微生物研究的代谢组学方法

准确、灵敏和高通量的研究方法是研究的基础微生物代谢组学研究．微生物代谢组学的研究过程通常包括样品制备、信号采集、数据处理分析和生物学解释。

样品制备

为了获得有意义的代谢组学数据，微生物代谢组学研究需要使用适当的样品制备步骤，包括快速采样、淬火和提取代谢物。

快速采样不仅可以防止底物浓度的大变化，还有助于保持微生物代谢物的稳定性。为了确保在给定时间内样品的真实信息，通常需要快速淬灭样品以终止代谢反应。理想的猝灭技术应该是快速猝灭酶活性并保持细胞或生物的完整性。

液氮冷冻或高氯酸失活技术是植物和动物代谢组学研究中主要的失活方法。但是这种方法不适用于微生物细胞的处理，不能分离细胞内和细胞外的代谢物。对于微生物的失活，冷甲醇及其缓冲溶液更常用。与酵母菌、丝状真菌等真核微生物相比，用冷甲醇灭活细菌等原核微生物更容易引起胞内代谢物的泄漏。由于细胞壁结构的差异，G-菌比G+菌更容易产生胞内代谢物的泄漏。如何保持细胞完整性，防止失活过程中胞内代谢物的泄漏，正确反映微生物细胞的生理状态，是微生物代谢组学研究的关键。

代谢产物的提取是微生物代谢组学研究的重要环节。为了从整体上分析代谢物，提取方法应满足以下要求:1)能够最大限度地提取代谢物;2)无偏性，不排除具有特定物理或化学性质的分子;3)不破坏或改变代谢物的物理或化学性质。目前常用的代谢物提取方法有冷甲醇、热甲醇、高氯酸或碱、氯仿-甲醇混合物和乙腈。

图1测定病原微生物及其代谢物的代谢组学过程(Bamikole等, 2020)。

代谢物的检测、分析和鉴定

质谱(MS)是微生物代谢组学研究的主要平台。

气相色谱-质谱联用(GC-MS)是微生物代谢组学研究中较为成熟的分析平台和最早的分析方法。

GC-MS能够同时分析数百种化合物(包括有机酸、氨基酸、聚糖、糖醇、芳香胺和脂肪酸等)，并配备标准代谢物库，对代谢物进行快速、准确的定性分析。然而，样品的衍生化是必需的。二维GC-MS技术显著提高了复杂样品的分离和检测灵敏度，可有效应用于微生物代谢组学。

液相色谱-质谱(LC-MS)技术是不需要对样品进行衍生化而分析不稳定、挥发性和非极性化合物的另一个重要分析平台。亲水相互作用液相色谱-质谱(HILIC-MS)是一种高通量细胞内代谢组学技术，可以同时分析极性和非极性代谢物。它的数据采集和分析速度是传统方法的两倍。

虽然LC-MS已经在很多研究中得到了应用，但是在基于LC-MS的微生物代谢组学研究中还存在一些问题，如培养基中盐浓度过高会抑制ESI的电离效率，堵塞泵，最终影响定量分析的有效性和可重复性。毛细管电泳-质谱(CE-MS)技术具有分析速度快、样品要求低、试剂消耗少、相对便宜等优点。

数据处理与分析

为了消除干扰因素，需要对原始数据进行预处理。数据处理一般包括基线校正、特征检测、噪声滤波、峰值对齐、归一化和归一化等步骤。目前有大量的软件可以将MS得到的原始数据预处理成二维数据表，如MZmine、XCM、METIDEA等。

预处理后的数据需要进行多变量统计分析，如PCA和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)，从中获得潜在的有效信息，以识别生物标志物和代谢途径等。代谢途径分析不仅有助于了解代谢物之间的相互作用，还有助于探索基因表达数据，完成功能基因组学研究。

参考

1. 巴米科尔，O. A.格林，E.等．(2020)。代谢组学方法用于病原微生物代谢物的测定:综述。国际食品研究中心，110042。

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