液相色谱法

液相色谱法(LC)用于分离和分析溶液中混合物的化学成分，以确定特定成分的存在或不存在或存在多少。高效液相色谱法(HPLC)是一种以高压下的液体为流动相，以粒径极细的高效固定相为色谱柱的色谱分离技术。

液相色谱系统图(Torreet al。, 2015)。

自动进样器将样品注入流动相，然后在柱中进行分离过程。色谱系统的选择性对色谱分辨率影响最大，应根据所研究的应用和成分进行调整。选择性可以通过改变流动相(不同溶剂)的电化学强度或固定相中存在的特定化学官能团(改变色谱柱类型)来改变。

考虑到流动相，在运行液相色谱仪时，有两种主要的操作模式可用，等压或梯度。等压法在色谱运行期间将使用相同的流动相组成，而不改变选择性。梯度方法将允许流动相的组成随时间变化，并且通常可以优化以提高色谱分辨率或减少运行时间。

固定化柱内固定相的化学性质影响该技术的选择性。反相HPLC或UHPLC是最流行的系统配置，使用非极性固定相(例如，ODS或C18)和极性流动相(水/甲醇)。其他反相固定相包括辛烷(C8)，它的疏水性比C18小，对于极性较低的分析物具有相应较短的保留时间。如果使用苯酚取代基功能化的色谱柱，由于苯酚的亲和力增加，这将增加苯酚组分的保留率。

正相色谱法是另一种根据极性分离分析物的液相色谱法。在常规相色谱法中，固定相是极性的，而流动相是非极性的。混合物的非极性组分首先被洗脱，保留时间最短。极性分析物对固定相具有较高的亲和力，并随后洗脱较长的保留时间。还有其他类型的液相色谱法，包括离子色谱法、尺寸排除法和亲和法。对于一组给定的待分离组分，可获得的选择性和色谱分离是由所使用的固定相和流动相决定的。

一旦分析物被分离，它们就需要被检测。检测器的选择是由应用程序的方法目标驱动的;各种选项可提供不同程度的灵敏度，特异性，选择性和线性动态范围。根据需求选择合适的检测器进行后续检测。

HPLC和UHPLC

亚2微米粒径分布窄的硅基固定相的发展使得色谱性能有了突破性的进展。生成的新颗粒与常用的HPLC固定相具有相同的化学性质，确保在使用相同的流动相时保持色谱系统的选择性。UHPLC具有许多优点，运行时间短，色谱分离率高，灵敏度高，溶剂消耗少。

对于UHPLC柱，有必要使用可以在更高压力下运行的泵，以适应柱中较小颗粒施加的增加的背压。检测器流动池也需要升级，使其内部体积更小，这对于检测从柱中洗脱的组分的较窄波段是必要的。还需要相应提高数据采集率，以确保峰值之间有足够的数据点。

液相色谱-质谱联用

尽管各种不同技术和灵敏度的检测器已与LC相结合，用于分析不同的样品类型，但质谱法已成为一种选择性，灵敏度和通用的检测器。

与其他检测器不同，携带分离分析物的LC洗脱液不允许流入质谱仪。当LC系统在环境压力下工作时，质谱仪在真空下工作，两者通过接口耦合。当柱洗脱液流入界面时，被分析物分子通过加热蒸发和电离以蒸发溶剂。质谱仪只能检测和测量气相离子。电喷雾电离(ESI)和大气压化学电离(APCI)是LC-MS分析中最常用的电离形式。

可分析的离子被吸入质谱仪。通过改变施加的电场和/或磁场来改变离子的飞行路径，离子根据它们的电荷质量比(m/z)彼此分离。分离后的离子可以被各种质量检测器收集和检测。

液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)

通过耦合两台串联运行的质谱分析仪，可以进一步提高样品鉴定和准确定量。三重四极杆质谱仪(QQQ或TQMS)和四极杆飞行时间(QTOF)是最常用的串联质谱仪。

目前，HPLC、UHPLC、LC-MS和LC-MS/MS已被广泛用于分析各种基质中的小分子，并可用于定量生物样品中的代谢物。药物代谢产物生物体液、活性药物成分中的遗传毒性杂质等。

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参考

1. Torre, C. A. L. D. L, Blanco, J. E.， Silva, J. T.， Paschoalin, V. M. F， & Conte, C. A.(2015)。动物源性食品中硝基呋喃的色谱检测。Arquivos do Instituto Biológico, 82,1 -9。