翻译后修饰（PTM）是指在酶催化后蛋白质发生的修饰。有各种类型的PTM，包括磷酸化，乙酰化，甲基化，糖基化等。PTMS在细胞生物学中起重要作用，包括细胞信号，细胞结构，DNA改性等。
为了分析蛋白质修饰，传统策略，如放射性标记和蛋白质印迹，可以具体且相对定量，但它们需要先验的修饰类型知识，并且受抗体可用性和特异性的限制。质谱（MS）是分析蛋白质修改的合适方法，因为它可以提供有关蛋白质修改的通用信息，而无需先验知识并定位修改部位。PTM识别有几种策略，包括自下而上，自上而下和下下方法。
图1所示。自下而上、中下和自上而下的策略(Moradian, Annie等，2014)
自底向上的策略
自底向上的PTM识别策略是传统的蛋白质组学方法。在自下而上的策略中，蛋白质通常被酶(如胰蛋白酶)消化成凝胶或溶液中的小肽。这些肽将被质谱仪检测，并可以在回收的肽中进行修饰。自底向上的方法比自顶向下的方法具有更高的灵敏度。然而，自下而上策略在表征蛋白质修饰方面存在一些内在的局限性。第一个原因是蛋白序列的覆盖率较低，导致未恢复序列部分的修饰状态未知。此外，由于蛋白质消化的丰富的小肽成分，样品的整体复杂性增加。此外，由于典型的胰酶消化肽只含有约5 ~ 20个氨基酸，蛋白质不同部分的修饰之间的连接可能会失去。
自上而下的策略
自上而下的蛋白质组学正在成为分析蛋白质修饰的强大策略。对于自上而下的策略，整个蛋白质在没有消化的情况下直接分析MS中，因此可以揭示修改状态的完整信息。它可以普遍检测所有现有的修饰，包括在1个频谱中同时检测PTM（即，磷酸化，蛋白水解和乙酰化）和序列变体（即，突变体，也是剪接的同种态性和氨基酸多态性），而没有先验知识。在该策略中，首先测量完整蛋白质的分子量并基于DNA预测的蛋白质序列与计算值进行比较，这可以揭示全球蛋白质序列的修饰。可以在质谱仪中直接隔离特异性修改的感兴趣，随后通过串联MS进行分段，以可靠地映射修改位点。虽然自上而下的策略具有蛋白质改性分析的许多优点，但仍有一些挑战需要解决，包括蛋白质溶解度，灵敏度和检测极限，以及高端仪器的要求。
Middle-down策略
最近下下蛋白质组学成为高吞吐量的策略，以定义PTM共存频率。下下方法可以被认为是自上而下方法的变种。在该策略中，蛋白质是软蛋白水解，以通过使用ASPN和Gluc获得大肽。然后使用类似于自上而下的技术通过串联质谱法测序肽。例如，下下策略可用于组蛋白分析，其中蛋白质通常在3至9kDa范围内消化成肽。下下方法很大程度上保留了组蛋白尾部的组合修饰，同时接近自下而上方法的灵敏度。
质谱碎片策略
图2.质谱分段方法
在基于ms的PTM分析中，生成肽片段信息对高可信度的序列识别和PTM位点定位至关重要。破碎策略有几种，包括碰撞诱导离解(CID)、高能碰撞离解(HCD)、电子捕获离解(ECD)和电子转移离解(ETD)。
CID，又称碰撞活化解离(collision - activated lysis, CAD)，是目前最常用、应用最广泛的单分子解离方法。在CID中，离子与中性分子(如)碰撞而带正电。CID技术通常对小而低电荷态肽更有效。HCD，被称为波束型CID，是轨道rap质量分析仪专用的CID技术。与CID相比，HCD具有更高的活化能，主要生成y型碎片离子。ECD和ETD是基于电子的碎裂方法，它们通过热电子(ECD)或自由基阴离子(ETD)中和主质子位点来实现碎裂。这样，在不丢失PTM定位信息的情况下，可以生成c和z型片段离子。CID只能在傅立叶变换离子回旋共振(FTICR)质谱上实现，ETD可以在高分辨率串联质谱仪器上实现。ECD和ETD在高电荷态分析物中表现更好，而CID在低电荷态肽中表现更有效。然而，ECD和ETD更适合检测不稳定PTMs，因为肽主链片段几乎不依赖于氨基酸序列，中性损失减少，O-GlcNAc消除不发生。
参考：
- 等。“翻译后修饰和质谱检测。”自由基生物学与医学65(2013):925-941。
- 莫拉德岛，安妮等人。“自上而下，下下和自下而上的质谱方法，用于表征组蛋白变体及其后翻译后修改。”蛋白质组学14.4-5（2014）：489-497。
- 多尔，索菲娅和阿尔玛·l·伯林盖姆。“基于质谱的蛋白质翻译后修饰的检测和定位。”ACS化学生物学10.1(2014):63-71。
- 张，韩和莹格。“通过自上而下的质谱法”综合分析蛋白质修饰。“流通：基因组和精密药物4.6（2011）：711-711。