Western blot由Towbin等人于1979年引入，是一种常用的蛋白质分析方法。可用于蛋白质的定性和半定量分析。为了完成western blot，有三个要素，按大小分离蛋白质，将蛋白质转移到固体载体上，用一、二抗体标记蛋白质以进行可视化。
西方印迹原则
采用聚丙烯凝胶电泳进行Western blot。SDS-PAGE可将蛋白质样品分离并转移到固体载体上，如硝化纤维素(NC)或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。固体载体能吸收蛋白质并保持其生物活性不变。转移的固体支撑膜称为印迹，用蛋白质溶液处理，以阻断膜上的疏水结合位点。用靶蛋白的抗体(一抗)处理膜。只有待研究的蛋白质才能与一抗特异性结合，形成抗原-抗体复合物。一抗洗去后，只有靶蛋白的位置与一抗结合。经一抗处理的膜在洗涤后用标记的二抗处理。治疗后，标记的二抗与一抗结合形成一个抗体复合物，可以指示一抗的位置，这两个位置都是正在研究的蛋白质。
Western Blot程序
western blot包括样品制备、凝胶电泳、蛋白转移、阻断、抗体孵育、蛋白检测及可视化6个步骤。
1.样品制备。
蛋白质可以从不同的样本中提取，如组织或细胞。由于组织样本显示了更高的结构，组织首先被机械发明分解，如均质器或超声。蛋白酶和磷酸酶抑制剂通常用于防止样品在低温下的消化。在提取蛋白质后，检测蛋白质的浓度是很重要的，这允许蛋白质装载到每个孔的质量。分光光度计通常用于蛋白质浓缩。
2.凝胶电泳。
最常用的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶(PAG)和负载十二烷基硫酸钠(SDS)的缓冲液。Western blot使用两种琼脂糖凝胶:用于将所有蛋白质浓缩在同一条带的堆叠凝胶和允许根据分子量分离蛋白质的分离凝胶。当施加电压时，较小的蛋白质在SDS-PAGE中迁移得更快。PAGE可根据不同浓度PAG控制的均匀孔径对5 ~ 2000 kDa的蛋白进行分离。典型的分离凝胶是5%，8%，10%，12%或15%。在选择合适的分离凝胶比例时，应考虑目标蛋白的大小。已知的蛋白质重量越小，使用凝胶的比例就越高。
3.蛋白质转移。
用凝胶电泳分离蛋白质后，蛋白质从凝胶内移动到固体支撑膜上，使蛋白质易于抗体检测。转移蛋白质的主要方法被称为电印迹法，它利用垂直于凝胶表面的电场，将蛋白质从凝胶中拉出来，并移动到膜中。它可以在半干或湿的条件下完成，而湿的条件通常更可靠，因为它不太可能干出凝胶。如图左图所示，膜被放置在凝胶表面和过滤器之间。转移夹层的制作方法如下:纤维垫(海绵)、滤纸、凝胶、膜、滤纸、纤维垫(海绵)。
4.阻塞。
阻断是蛋白印迹的一个重要步骤，可以防止抗体非特异性地与膜结合。最常用的典型阻滞剂是牛血清白蛋白和脱脂奶粉。当薄膜被放置在蛋白质的稀溶液中时，蛋白质会附着在膜上所有目标蛋白质没有附着的地方。这样，western blot的最终产物中的“噪音”就可以被减少，从而得到更清晰的结果。
5.抗体孵育。
阻断后，当一抗与细胞膜孵育时，一抗与靶蛋白结合。一抗的选择取决于要检测的抗原。用抗体缓冲溶液清洗膜有助于减少本底和去除非结合抗体。冲洗膜后，将膜暴露于特定酶结合的二抗。二抗孵育时，标记的二抗可与与靶蛋白反应的一抗结合。根据一抗的种类，可以选择合适的二抗。
6.蛋白质检测和可视化。
底物与与二抗结合的酶反应生成有色物质。它使我们能够知道靶蛋白的密度和位置。而大小的近似是通过将蛋白质带与标记物进行比较得出的。有几种检测系统可用于蛋白质可视化，如比色检测、化学发光检测、放射性检测和荧光检测。电化学发光(electrochemiluminescence, ECL)系统是最常用的检测方法。
western blot通常用于蛋白质和翻译后修饰(如磷酸化)的定性检测。此外，它还可以用于医学诊断，如艾滋病毒检测或疯牛病检测。
参考:
- 杨平。蛋白质印迹:技术、理论与故障排除。中国生物医学工程学报，2012,31(4):429。