二维凝胶电泳（2-DE）被认为是蛋白质组学工作的强大工具。它用于从生物样品中分离和分离复合蛋白质混合物。2-DE将蛋白质分离取决于两个不同的步骤：第一个称为等电聚焦（IEF），其根据等电点（PI）分离蛋白质;第二步骤是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），其基于分子量（相对分子量，MR）分离蛋白质。因此，可以分离成千上万的蛋白质，并且可以获得关于IEF和分子量的信息。成功2-DE分析有几个步骤。
样品制备
谈到样品制备，需要将天然样品转化为适合于第一维度IEF的物理化学状态，并保持本地电荷和组成蛋白的MR。为了获得良好的结果，适当的样品制备至关重要。样品制备是各种各样的，因为蛋白质的类型和起源的差异。理想情况下，该过程将导致样品中蛋白质的完全溶解，分类，变性和减少。
第一维:等电聚焦(IEF)
正如我们上面提到的，第一个维度根据蛋白质的pI来分离蛋白质。蛋白质是两性分子，它们携带的正电荷、负电荷或零净电荷取决于周围环境的pH值。等电点(pI)的定义是，当蛋白质的净电荷为零时溶液的pH值。带正电荷的蛋白质会向阴极迁移，带正电荷减少，直到达到pI。而带负电荷的蛋白质会向阳极迁移，负电荷减少，直到达到pI。
具体来说，在pH梯度凝胶的基本末端装载蛋白质混合物。在施加电场后，蛋白质根据电荷分离，聚焦在pl值与周围ph值相等的位置。较大的蛋白质在凝胶中移动得更慢，但只要有足够的时间，就会赶上电荷相等的小蛋白质。
第二个维度:sds - page
在第一尺寸之后，可以在板坯凝胶上的平板玻璃或垂直系统上执行第二尺寸分离。第二尺寸通常由SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）进行，这是根据其分子量（MR）分离多肽的电泳方法。该方法通常包含四个步骤，包括制备凝胶，SDS缓冲液中的固定的pH梯度（IPG）条的平衡，将平衡的IPG条带放在SDS凝胶上，最后处理电泳。
SDS可以使蛋白质变性，并以恒定的摩尔比与主链结合。当使用SDS和还原剂(如DTT)时，蛋白质展开成线性链，负电荷与多肽链长度成正比。聚丙烯酰胺形成网状基质，适合于分离蛋白质。当蛋白质被SDS-PAGE分离时，越小的蛋白质迁移越快，因为抗性越小。
结果可视化:染色
有各种方法可视化蛋白质，但最常用的是Coomassie蓝染色和银染色。银染色是一种敏感和非放射性方法。银染色原理非常简单。氨基酸侧链可以与银离子结合，伯磺酰酮和羧基的羧基，然后还原到游离金属银。结果，蛋白质带被可视化为减少的斑点。由于其灵敏度（在非常低的NG范围内），银染色适用于低蛋白质水平。
考马斯蓝染色法相对简单，比银染色法更定量。适用于蛋白质含量在0.2 μg以上的蛋白带的检测。考马斯西染料通过范德华引力与蛋白质结合形成蛋白质-染料复合物。考马斯氏染料有两种，R250和G-250。
蛋白质的进一步分析。
在有几千个斑点的大型研究中，几乎不可能发现几个新斑点的出现或单个斑点的消失。此外，通过手工比较来评价两种凝胶也是不可能的。因此，需要利用图像采集硬件和图像评价软件对凝胶进行差异检测和信息获取。有Melanie、PDQuest、Progenesis、REDFIN等2D凝胶分析软件。该凝胶可用于质谱鉴定和其他应用。
2-DE是一种广泛应用于蛋白质分析的方法，可以一次分离数千个蛋白质。它可以提供蛋白质/翻译后修饰(PTMs)丰度变化的直接视觉信息。它也可用于其他分析，如全蛋白质组分析、生物标志物检测、药物发现等。
参考：
- 伯克尔曼T. 2D使用固定的pH梯度，原理和方法电泳。来自Amersham Biosciences的手册，1998年，57。
- Magdeldin s，enyany s，yoshida y等。基础知识和最近二维聚丙烯酰胺凝胶电泳的进展。临床蛋白质组学，2014,11（1）：16。