宿主细胞蛋白
宿主细胞蛋白是生物药理中最大蛋白质污染物,来源于重组脱氧核糖核酸技术多数生物处理技术使用重组脱氧核糖核酸技术使用优先宿主细胞表达目标蛋白药宿主细胞还表示大量蛋白质,重组蛋白药将受HCP污染即使在复杂净化步骤后,HCP低富集度(1-100ppm)可能保留在最终生物药剂产品中
生物产品残留HCP内容通常是产品关键质量属性剩余宿主细胞蛋白可触发体间不同程度的免疫响应,甚至引起厌食休克
除安全问题外,HCP的存在还可能影响产品质量。举例说,HCP可触发治疗性蛋白质聚合或分片HCP中的蛋白质活动还可能影响文化超级目录中的蛋白质组成,从而影响随后蛋白净化过程或蛋白质药的长期存储稳定性
此外,HCP可能在翻译后修改,使量化和定性更加困难。
HCP可能影响产品安全性能世界卫生组织、欧洲联盟和林业局等监管机构要求识别和量化HCP生物药剂产品以确保安全
如何实现分析主机蛋白?
由于蛋白质药中蛋白质富集广线性动态范围(覆盖四到五级规模),HCP检测极具挑战性研发转基因药物期间,可用几种方法检测HCPs和其他杂质
开工寄生虫免疫检测
HCP分析方法中,反HCPESELISA被视为金标准这种方法(检测1-100 ppm范围蛋白浓度)适合产品开发与流程控制反HCPsELISA检测不到单目标,传统HCP抗体准备法是使用装有空表达矢量的宿主细胞准备抗原对动物进行免疫以获取抗血清并隔离净化多克隆抗体以便ELISA检测生产HCP抗体/标准试剂时,必须确保具体生产细胞线和生产过程以及蛋白浓度的精确量化通用HCPELISA方法开发使用多克隆抗体反父细胞解析或细胞培养超生体可检测大多数HCP物种,但可能无法检测特定制造过程所特有的蛋白子集
目前HCP免疫检测设计验证面临以下挑战:
1) 动态范围窄小(<100),开发周期长,成本高,故障风险高
2) 遗传工程药方面可能有各种HCP
3) 一般多克隆抗体试剂用于检测,可能导致不准确结果
4) 不同的蛋白质有相似顶点,产生假阳性
5)钩效果高丰度蛋白导致检测饱和
6) 缺少完全匹配量化标准
script图scriptELISA用于HCP检测测量et al.,2015)
二叉二维凝胶电阻2-DE
含荧光染色二维分析法是另一种常用HCP分析法2-DE常用于上游或下游进程开发与定性二维原则是根据异电点(第一维)和大小(第二维)分离不同的蛋白质gel中的点分析不要求免疫计数,避免膜转移步数,并可以从产品中分离微量HCP杂质但这种方法只能进行半量化分析,因为动态范围狭窄(2至3级规模),需要与其他技术(如质谱测量法)合并识别HCP
3级质谱学
MS越来越多地用于检测HCP以便帮助识别可能的风险因素并评价净化过程ELISA最常用检测总HCP值,但无法识别ELISA包检测范围以外的HCP值与传统ELISA方法相比,质谱法的长处有短开发时间、所有HCP的具体确认和量化、所有杂质蛋白的非偏差检测、高动态范围(可达6级级)和快速调整等。
UPLC/MS通用分析可在生物处理蛋白样本中全面识别和量化HCP分析法使用在线二维液相色谱分离pepti
并行反应监控质谱量化技术可扫描由父离子生成的所有产品离子,高识别精度和量化吞吐量,并精确识别目标HCP
引用
王F,理查森D,ShameemM宿主细胞蛋白度控件生物药理学院 2015 2832-38