蛋白质磷酸化是可逆过程，其特征在于加入从ATP捐赠的磷酸盐并从磷酸化蛋白质基质中除去磷酸盐。并且蛋白质磷酸化由蛋白激酶和磷酸酶（PP）催化。在真核细胞中，约86.4％的蛋白质磷酸化事件发生在丝氨酸（Ser或S）上，而11.8％蛋白磷酸化事件发生在苏氨酸（Thr或T）上发生，而仅在酪氨酸（Tyr或Y）残基上仅为1.8％。
蛋白质磷酸化在许多细胞过程中起重要作用，包括细胞周期，生长，细胞凋亡和信号转导途径。此外，磷酸化可以调节酶活性，改变其对其他蛋白质的亲和力，并通过经常分支和交互式的激酶级联传输信号。为了理解这些机制，有必要分析蛋白质磷酸化。有许多用于磷酸化分析的方法，包括激酶活性测定，磷光体特异性抗体发育，蛋白质印迹，酶联免疫吸附测定（ELISA）以及细胞内流式细胞术和免疫细胞化学/免疫组化（ICC / IHC）。除了这些方法之外，MS分析在磷酸化分析中起着重要作用。通过自下而上的蛋白质组学鉴定蛋白质磷酸化位点存在两种常见策略，包括鉴定来自单个蛋白质和小蛋白质复合物的磷酸化位点，并鉴定来自整个细胞和组织提取物的全局磷酸化位点。
单蛋白（蛋白质复合物）磷酸化位点测绘
鉴定感兴趣的特定蛋白质的磷酸化位点对于综合研究磷酸化与蛋白质的功能作用很重要。有几个步骤。
- 样品制备。由于磷酸化肽相对于未修饰肽的化学计量水平较低，因此需要尽可能多地纯化蛋白质，以确保液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的成功。这通常是通过诸如FLAG、HA或Myc等表位标签或通过适当抗体的免疫沉淀(IP)完成的。此外，还可用sds -聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或沉淀法纯化蛋白质。富集磷酸化肽的方法有多种，包括金属离子亲和层析(IMAC)和二氧化钛珠(TiO2）.
- 通过LC-MS / MS进行分析。可以通过与电喷雾电离（ESI）偶联的液相色谱或基质辅助激光/解吸电离（MALDI）通过液相色谱将肽引入质谱仪中。使用碰撞诱导的解离（CID），MS / MS最常由MS / MS测序肽，与惰性气体的碰撞导致质子化肽沿着骨干酰胺键在酰胺键处的片段。电子捕获解离（ECD）和电子转移解离（ETD）可用于磷酸化分析。
- 数据分析。信息学软件是必要的，以识别肽序列及其相应的磷酸化。一些数据库搜索引擎是可用的，包括吉祥物，Sequest, MaxQuant和X!Tandem。
质谱法全局分析蛋白质磷酸化
随着磷蛋白富集方法的出现以及质谱技术的改进，大量的磷蛋白和磷酸盐被鉴定出来。随着MS仪器的进步，允许快速和敏感的肽测序和同时发展的肽富集策略，我们现在有能力分析蛋白质磷酸化的变化在一个前所未有的规模。在数百项研究中，在大量的原核生物和真核生物中发现了超过30万个磷酸化位点，其中仅哺乳动物就有超过20万个磷酸化位点。95%以上的位点已经通过基于质谱的磷蛋白组学鉴定出来。
从生物源位点中捕获pSer/pThr/pTyr位点的全局磷酸化位点分析是一项费时费力的工作。它有几个策略。
- 该策略包括消化整个细胞裂解液，然后用强阳离子交换色谱(SCX)对肽进行分离，用IMAC或TiO富集肽2．
- 在该策略中，蛋白裂解液可通过SDS-PAGE、酶切、磷酸肽富集和LC-MS/MS进行分离。
- 此外，还可以使用pTyr抗体，然后LC-MS/MS只IP磷酪氨酸肽。
对于全球磷酸化的真正比较分析，定量的蛋白质组学策略是必要的。定量磷蛋白组学使研究人员能够研究不同模型系统中的信号通路，以确定由于给定刺激的丰度和持续时间不同的磷酸化事件。
提供先进的设施，创意蛋白质组学可以提供磷酸化服务以负担得起的方式。我们的专家团队具有丰富的经验，可以帮助您了解您正在试图调查什么，并为您提供最合适的解决方案。
参考文献：
- 汉弗莱，肖恩·J，大卫·e·詹姆斯，马提亚斯·曼。蛋白质磷酸化:代谢调节的主要转换机制。内分泌与代谢趋势26.12(2015):676-687。
- 布赖特科普夫，苏珊·B和约翰·m·阿萨拉。"用质谱法测定体内磷酸化位点"分子生物学当前协议(2012):18-19。
- 麦克纳尔蒂、迪安·E、蒂莫西·西科尔斯基和罗兰·s·安南。"用质谱法鉴定和分析蛋白质磷酸化"蛋白质翻译后修饰的质谱分析(2016):17-87。