在用于蛋白质消化的内蛋白酶中，丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶是最常见的一种，因为它产生了高度符合MS（/ MS）分析的肽。取决于前面的工作流程，蛋白质的酶消化是凝胶或溶液中的。通常，凝胶中消化方法已经成为二维电泳分离的蛋白质的常规，而在溶液消化通常用于LC-MS / MS分析中。在消化期间，将蛋白质酶促切入有限数量的较短的片段，或肽，以允许以其特征质量和图案鉴定蛋白质。
在通过1-D或2-D凝胶电泳分离样品之后，使用MS相容的染色，通常是Coomassie蓝，或使用无戊二醛方案的银，固定并可视化。可视化蛋白质从凝胶中切除，并且在胰蛋白酶化之前洗涤各自的凝胶带或斑点以脱水和脱水。
据信通过用乙腈处理并随后在含有蛋白酶的消化缓冲液中溶胀，通过凝胶片的脱水促进酶对凝胶的渗透。对酶渗透到凝胶的不同研究表明，该方法几乎完全由扩散驱动。通过将凝胶切割为尽可能小的碎片，可以实现凝胶中消化的效率。
表面活性剂（洗涤剂）可以帮助凝胶中蛋白质的溶解和变性，从而缩短消化时间，增加蛋白质切割和提取肽的数量和量，特别是对于脂质蛋白如膜蛋白质。可切割的洗涤剂在消化后裂解，通常在酸性条件下。这使得添加与质谱相容的洗涤剂。
为了确保嵌入在凝胶基质中的那些蛋白质的有效水解，通常使用相对高的酶浓度。随后可以从凝胶基质中释放所产生的蛋白水解肽，例如50％乙腈（ACN）/ 5％甲酸（FA）用作萃取缓冲液，与超声处理组合。为了满足具有不同物理和化学性质的肽的要求，进行碱性或酸性溶液的迭代萃取。
凝胶中消化和肽提取的效率取决于各种因素，包括：（i）蛋白质的物理化学性质和所得肽（例如，疏水性，疏水程度，尺寸，氨基酸序列）;（ii）凝胶件的组成，尺寸和厚度;（iii）萃取缓冲液的组成（例如，乙腈（Acetonitrile（AcN）浓度）;（iv）酶类型及其特定活动;（v）一般反应条件（例如，温度，时间，酶与基材的比例）;（vi）蛋白质染色的类型（例如，Coomassie或银）。
凝胶蛋白质消化的一个显着优点是在电泳期间已经除去任何污染物（例如，洗涤剂，盐），使得产生的肽样品可以容易地进行（LC /）ESI-MS分析。然而，由于蛋白酶的蛋白质可达性和/或来自凝胶基质的肽的缺失的低释放，以及凝胶的储存不足，因此可以限制该程序的有效性。作为与凝胶电泳结合的凝胶电泳的优异替代品，可以直接消化溶液，其通常是1-D或2-D LC，以在ESI-MS之前有效地分离所得肽混合物。
对于溶液消化，必须达到蛋白质溶解和酶活性之间的折衷。在含有蛋白质中可能实施的胱氨酸或半胱氨酸的还原和烷基化（R＆A）中，蛋白质的二硫键是不可逆地分解的，并且获得了三级结构的最佳展开。该化学改性允许具有大量二硫键的蛋白质成功鉴定以及最高的肽产率和序列覆盖。对于变性电泳，强烈建议在执行电泳前进行反应，因为凝胶中的游离丙烯酰胺单体能够改变半胱氨酸。
通常应该避免洗涤剂。但取决于蛋白质化物质的物理化学特性，可以使用有机溶剂和/或椎间络合物。为了分析难以溶解或变性的蛋白质（例如，膜蛋白），8M尿素可以与弹性蛋白酶Lys-C结合使用;随后，以减少的螯合（2M尿素）浓度进行胰蛋白酶。使用FA酸化后，可以直接执行LC / ESI-MS，尽管通常建议执行额外的脱盐步骤。作为尿素中双重蛋白水解消化的有前途的替代方案，有机溶剂可用于溶解和有效地消化疏水性蛋白质溶液。为了增强蛋白水解消化，可以使用化学固定或物理吸附到固定相的酶。