根据代谢组学标准倡议的定义，代谢物鉴定置信度分为四个级别：可靠鉴定化合物（1级）、推定注释化合物（2级）、推定注释化合物类别（3级）和未知化合物（4级）。确定性（1级）鉴定要求将相关代谢物的两个或多个正交性质（如保留时间、m/z和裂解质谱）与在相同分析条件下观察到的真实化学标准的相同性质进行比较。假定的（2级或3级）注释基本上只依赖于一个或两个属性，并且通常基于对不同实验室收集的数据和用不同分析方法获得的数据的比较，而不是在相同分析条件下与真实化学标准的直接比较。

一种未知的代谢物是一种小分子，可以反复检测，但其化学特性尚未确定。虽然这些化合物还未被鉴定和分类，但在基于光谱数据的代谢组学实验中仍然可以被区分和定量。在液相色谱-质谱实验中，未知化合物可由一个独特的保留时间、一个或多个质量或一次离子的特定碎裂模式来定义。在核磁共振实验中，一种未知化合物将由化学位移的模式来定义。未知分子可能代表先前未记录的小分子，例如代谢的次级产物或稀有的外源性物质，或者它们可能构成来自已建立的途径的分子，但不能与当前的核磁共振参考光谱库或质谱裂解模式一起分配。

鉴定未知化合物是一项费时且成本高的工作，通常需要制备规模的分离，用于核磁共振研究或广泛的化学合成，使用MS/MS进行结构比较。因此，不出所料，大多数报告的重点是检测代谢物可用的真实商业标准或至少存在于代谢物数据库。由于许多代谢物固有的不稳定性和缺乏需求，只有几千个商业分析标准可供使用。然而，这些标准和数据库中存在的代谢物只占内源性代谢物的一部分。因此，有效的方法对未特征代谢物进行优先排序、研究并最终识别，对于代谢组学的研究具有重要意义。未知代谢物的成功鉴定将对生物标志物的发现和组学研究产生重大影响。

为了鉴定代谢组学样品中的未知化合物，应区分不同的代谢物组。应区分不同标称质量的代谢物、具有相同标称质量但分子式和单同位素质量不同的代谢物以及具有相同标称质量和单同位素质量但化学结构不同的代谢物。例如，亮氨酸和异亮氨酸是结构不同的异构体，但具有相同的标称质量和单同位素质量。更重要的是，由于在质谱仪中可以检测到单个代谢物作为各种衍生物种，因此正确地将各种衍生物种分配给母体代谢物是非常重要的。例如，在氨基酸分析中，三甲基硅烷基化（TMS）与氨基酸的化学衍生反应会产生含有1、2或3个TMS基团的氨基酸，它们都应该属于同一个母体氨基酸。

通过结合NMR、LC-MS/MS和基于规则和算法的方法，Creative Proteomics开发了一种识别未知代谢物的新策略，允许在复杂的生物样本中准确识别代谢物。创造性蛋白质组学仍在开发工具和数据库，并提供这些不同的工具和数据库的集成，以便在未来以自动化的方式真实和完整地识别所有代谢物。

排序过程: