点图的评价是二维电泳技术中要求最高的部分,对图像进行比较和自动分析。比较二维凝胶模式,以检测定性和/或定量蛋白ex
为了评估和比较复杂的二维模式,凝胶图像必须用扫描仪或相机转换成数字数据,然后用计算机软件进行进一步分析。在成像分析中,通常采用100mm的像素格式进行扫描,较高的像素分辨率并不能提高成像分析,图像文件会变得太大,无法在合理的时间内进行处理,占用大量硬盘空间。
扫描仪必须用灰色阶梯片校准。测量的无因次强度转换为OD值或吸光度单位。为了根据成像分析的数据准确拾取点,x/y位置需要在mm公差范围内绝对正确。通常x/y数据必须在网格的帮助下为每个扫描仪进行校准。这些校准数据必须输入到每台扫描仪的点选计算机中。
在二维图像的成像分析中,背景差函数容易引起误差。经过多年的经验与现货量量化,人们已经发现,通过定义现货边界最大峰值的75%,计算只现货体积边界上的值,相对现货量量化是非常接近真实情况,确保一个很高的再现性。
在蛋白负荷和染色变化的归一化过程中,点体积与凝胶的总点体积完全自动归一化,无需任何用户交互。
pI和Mr注释的校正通常有两种方法。
一维校准。校准曲线由IPG pH梯度图导出用于pI测定,从共运行分子量标记的位置导出用于第二次维Mr测定的梯子。
二维标定。在二维校准中,pI和Mr值是通过在质谱分析的已知值之间进行插值来同时校准的。选择一些蛋白质性质已知的点,从属于这些点的各自的蛋白质列表中输入pI和Mr信息。
对于差分分析来说,能够叠加点图是很重要的。这不能直接做到,因为通常存在由凝胶基质的缺陷、凝胶运行条件的变化、温度影响、聚焦不均匀和聚合问题引起的局部扭曲。以往的点匹配是在对凝胶中寻找对应的点,而自动匹配是通过点簇、点形状、大小和位置来搜索对特征,这样效率更高。然而,即使是这种基于特征的匹配有时也会产生不匹配,因此有必要通过视觉检查来控制这个过程,并通过设置地标来进行校正。