iTRAQ/TMT蛋白质组学分析的优点是什么?
答:不同样品之间蛋白质组比较的目的是通过对不同来源、不同分子量的样品进行实际标记来实现的。
- 一次性完成所有样品的定性和定量分析(iTRAQ 8/TMT 16)
- 减少实验误差
- 消除了仪器仪表引起的样品间变异
- 高稳定性
- 简单的操作
- 简单的数据分析过程
- 适用于各种蛋白质的定量分析
iTRAQ和TMT的主要区别是什么?
答:TMT(串联质量标签)和iTRAQ(等压相对和绝对定量标签)技术分别是由Thermo和AB SCIEX开发的体外肽标记和定量技术。它们是定量蛋白质组学中使用最广泛的两种标记技术，具有相似的原理。主要区别是TMT可以标记多达16组不同的生物样本，而iTRAQ可以同时标记多达8组不同的生物样本。
在进行iTRAQ&TMT标记实验时需要注意什么?样品的要求是什么?
答:iTRAQ&TMT适用于同一组织的相对定量分析，有无均不能鉴别。不同的组织部分不能在机器上一起标记，未使用的物种的样品也不能在机器上一起标记。总蛋白质需要量高于LFQ, 100ug以上。
为什么iTRAQ/TMT不能用于差异较大的物种或样品?
答:这主要是由于iTRAQ/TMT的技术特性。标记物定量的数据分析是基于共享的蛋白质。具体的蛋白质将被过滤掉，不能在后面的数据中进行分析。因此，iTRAQ/TMT不能用于差异较大的种或样品。
不同组织类型的样品可以在同一批次用于iTRAQ/TMT吗?
答:样品必须是同一物种和同一组织类型，才能在同一批次进行分析。如果你选择不同样本类型的样本，它们的特定蛋白质将被过滤掉。
为什么不能从同一批次的iTRAQ/TMT样品中选择一些单独分析?
答:iTRAQ/TMT是混合批，数据质量控制以运行为基础(即起始分数)进行。得到的总蛋白是机器上所有样品的共同蛋白。所以没有办法单独分析。
是否可以通过iTRAQ/TMT实验在不同样品之间寻找差异蛋白或独特蛋白的存在或不存在?
答:不，不可能。这有几个原因。
- iTRAQ实验的结果使用Proteome Discoverer软件进行库搜索，该软件的算法分析为非常大的值和非常小的值赋值。
- 对于蛋白质定量，该软件使用联合肽水平测定，这使得它很难排除其他类似的离子干扰。
- 少量没有定量值的蛋白质可能是没有检测到独特肽的结果，或者报告的离子峰太低，并不能表明蛋白质的缺失。
如何选择iTRAQ/TMT实验筛选的差异蛋白进行验证?
答:大规模的组织学数据需要后期具体的验证实验来支持组织学数据和结论的可信度。可以通过以下方式进行选择。
- 研究已知与研究课题密切相关的蛋白质的相关文献报道，以便进一步研究
- 优先选择定量蛋白质组差异倍数大的蛋白质进行研究
- 在已鉴定的差异蛋白中选择独特肽数量相对较多的蛋白质(独特肽数量越多，置信水平越高)
- 选择组间平行性好、表达趋势一致的蛋白进行进一步研究(趋势越一致，蛋白变化越可信)
- 结合功能分析或通路分析(生物信息学分析)选择有意义的蛋白质进行研究
如何进一步验证iTRAQ/TMT实验筛选的差异蛋白?
答:验证方法有很多，如Western blot, ELISA, PRM(平行反应监测)，PRM是基于靶向蛋白质组学来研究特定蛋白质的表达变化。还可以使用代谢组学、基因组学和其他多组学相互验证。
为什么通过iTRAQ/TMT实验筛选的差异蛋白随后没有得到验证?
答:可以从以下几个方面考虑。
- 验证目标的选择是否合理，实验是否可重复、可靠
- 蛋白修饰水平的验证是否具有时效性
- 在验证的不同阶段，如基因水平到蛋白质水平，可能存在表达差异。大规模数据的筛选会出现一些假阳性。
为什么Elisa和WB检测到的蛋白质在iTRAQ/TMT或蛋白质鉴定试验中没有检测到?
答:Western blot方法通过多步扩增靶蛋白信号，灵敏度高，(特异性结合除外)特异性强，特异性检测靶蛋白。它几乎不受复杂样品中背景蛋白丰度的影响。对于纯蛋白质样品，质谱检测灵敏度可达fmol水平。但在复杂样品中，质谱检测并不具有特异性，而是优先选择样品中丰度较高的蛋白质进行检测。相反，由于肽信号太弱而无法被淹没，因此丰度较低的蛋白质不会被检测到。因此，如果样品中待检测的目标蛋白丰度低(或分子量小)，即使WB能检测到，质谱也不一定能检测到。
