CoIP我需要准备多少样本量?
CoIP实验需要保证足够的蛋白质浓度来维持原本存在的蛋白质相互作用，特别是当蛋白质丰度较低、相互作用力不强或使用不易提取蛋白质的组织时。因此，单元格>2x107CoIP实验应准备动物组织>500mg和植物组织>2g，采集后应多注意-80℃保存，避免反复冻融。
CoIP蛋白降解呢?
- 注意冰上操作
- 添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂
为什么IgG组和IP组都能检测到目标条带?
CoIP-WB鉴定结果显示，IgG组无靶蛋白条带，IP组有靶蛋白条带，说明IP过程成功。质谱分析极不可能识别出IgG组中的目标条带。如果是这样的话，有可能是在凝胶切割和质谱样品处理过程中发生了串扰，这对IP组中互反蛋白的结论没有影响。
为什么两个蛋白质通过Co-IP相互作用，而不是通过其他验证方法相互作用?Co-IP不可靠吗?
Co-IP可以验证两个相互作用的蛋白质之间的关系。缺乏与其他验证方法的相互作用可能是由于Co-IP中存在参与相互作用的中间蛋白。
为什么其他方法可以验证两个蛋白质之间的相互作用，而Co-IP不能?
Co-IP不能检测弱相互作用或蛋白表达过低。
为什么Co-IP实验中没有检测到与靶蛋白相互作用的蛋白或者检测到的信号太弱?
蛋白质与蛋白质之间的相互作用可能太弱或不稳定。
Co-IP中的input/IP/IB分别指什么?
输入是指总蛋白，这是一个阳性对照;IP是对应蛋白与对应抗体的沉淀;IB为倒数信号。
Co-IP检测的抗体要求是什么?
对于自身蛋白抗体，抗体需要为IP级，并需要测试效力。市售的标记抗体也需要是IP级的。
如何避免Co-IP检测的假阳性?
(1)如果抗体浓度过高，请降低抗体浓度。
(2)如果抗体特异性差，则更换抗体。
(3)如果蛋白质丰度很高，增加洗涤次数。
ProteinA/G琼脂糖珠在Co-IP中的作用是什么?
ProteinA/G与免疫球蛋白的FC片段特异性结合，因此与抗体结合。抗体与靶蛋白结合，靶蛋白与相互作用蛋白结合。
在Co-IP实验中使用的对照抗体是什么?
- 单克隆抗体:正常小鼠IgG或其他类型的单克隆抗体。
- 多克隆抗体:正常兔IgG。
- 如果是标记抗体，则使用相应的标记蛋白作为对照。
Co-IP实验中阴性对照的意义是什么?
排除非特异性蛋白质的结合。
在Co-IP实验中如何去除重链和轻链的影响?
目前的商业纳米体可以有效地避免这种情况，或者在WB过程中使用特定的二抗可以排除这种情况。
Co-IP中没有检测到与靶蛋白相互作用的蛋白或者检测到的信号太弱的原因是什么?
(1)裂解液中洗涤剂浓度过高或配方过激
降低洗涤剂的浓度或更换洗涤剂的种类。
(2)受蛋白亚细胞定位的影响
重新选择裂解液配方以释放目标蛋白。
(3)蛋白质-蛋白质相互作用太弱或不太稳定
选择亲和力较高的抗体，以捕获更多的目标蛋白，从而获得更多相互作用的蛋白。
(4)过表达，增加目的蛋白含量
选择目标蛋白或相互作用蛋白含量高的样品进行免疫沉淀实验。
如果Co-IP样本被蛋白酶降解，我该怎么办?
添加蛋白酶抑制剂，并将所有操作保持在4°C以下的冰上，防止冻融。
如果Co-IP抗体浓度过低怎么办?
调整IP和/或IB抗体的浓度，必要时建立浓度梯度，以找到最佳浓度。
抗体亲和力过低怎么办?
选择合适的IP和/或IB抗体。
如果IP抗体不能与琼脂糖珠结合呢?
为IP选择合适的珠子并妥善保存，以防止变质或干燥。
如果标签没有暴露在融合蛋白构象的表面会怎样?
更改标签融合表达位点。
如果裂解液浓度过高怎么办?
将裂解液改为低浓度的裂解液。
IP和Co-IP有什么区别?
IP:是在已知某一蛋白质有抗体的情况下，用该抗体直接提取目标蛋白来纯化蛋白质的方法。
Co-IP:主要用于检测蛋白质-蛋白质相互作用。最终产物是多种蛋白质复合物。
为什么IP后用WB鉴定出了目标蛋白，却没有用质谱鉴定出目标蛋白?
质谱无法识别目标蛋白通常是由于样品中蛋白质本身的相对丰度较低。其他相对高丰度的蛋白质可能会在质谱分析过程中掩盖一些信号，导致样品中无法识别低丰度的蛋白质。
一个成功的Co-IP实验的标准是什么?
有目标带的输入，无目标带的阴性对照，有目标带的倒数组表示Co-IP成功。
在Co-IP的下游还可以进行哪些分析实验?
通过Co-IP获得的样品可以通过WB在特异性抗体的帮助下验证特定蛋白(即互反蛋白)的存在。蛋白质分析也可以用来鉴定相互作用的蛋白质和寻找未知的相互作用的蛋白质。
