无标签量化问答

• 无需标签;操作简单
• 不受被比较样本数量的限制
• 对实验操作的稳定性和再现性要求高
• 比标记量化的准确度稍低
• 至少需要三次技术或生物复制

无标记是一种非同位素标记技术。样品内部没有同位素标签，每个样品单独消化，然后依次独立进行色谱分离和质谱分析。然后通过比较不同样品中相应肽的信号强度来进行相应肽蛋白的相对定量。因此，无论相同的蛋白质或基因，任何类型的样品都可以进行比较。

HPLC分级降低了每个馏分中蛋白质的复杂性，增加了每个馏分中每个蛋白质的含量，这有利于质谱鉴定。我们需要根据样本的复杂程度对其进行分级。等级过少不会降低样品的复杂性，而等级过多则会降低每个分数中每种蛋白质的含量。

当样品过于复杂时，相似的m/z太多，导致初级质谱鉴别无效，最终导致峰面积提取异常，产生定量不准确。

质谱的特点是，如果对同一样品进行多次重复质谱分析，每次质谱识别的结果不会完全相同(Overlap约70%)。只要在质谱分析结果中鉴定出一种蛋白质，就意味着该蛋白质存在于样品中。但是，为了后续的统计分析，一般的准则是选择在三次质谱重复实验中至少两次确定的数据(即有定量值和非零定量值的数据)并取平均值。如果一个值只能在一次实验中得到，则该数据不用于定量分析。

当一个样本组中的一个蛋白在三个定量结果中没有值(或显示为“0”)，而该蛋白在另一个样本组中至少两次具有非零的定量值时，可以认为这种差异是“有或没有”表达差异。然而，质谱结果“有或没有”差异的结论必须谨慎做出，并需要其他实验方法进一步验证。

对于无标签项目，我们使用MaxQuant软件的iBAQ或LFQ算法进行定量分析。两种算法均以MS1为基础，计算每个肽信号在LCMS色谱上的积分。iBAQ算法相对较新，应用也比较广泛，所以一般情况下我们提供iBAQ算法的定量结果。

原因1:有两种类型的肽属性，一种是可用于蛋白质表征的肽属性，另一种是用于蛋白质定量的肽属性，定性肽的数量≥定量肽的数量。如果没有唯一的肽可以用来定量所鉴定的蛋白质，则该蛋白质没有定量价值。在这种情况下，所有样本的强度表示为0。

原因2:如果某些样品中用于蛋白质定量的肽信号值过低，会导致峰面积积分定量没有值，从而导致该样品中的强度显示为0。

我们的无标签项目一般使用MaxQuant软件进行蛋白质表征和定量分析。通过搜索Targetdatabase和Decoy库(Decoy库由MaxQuant软件自动创建)计算FDR，得到匹配配置文件的个数。FDR≤0.01是筛选组织学资料的公认标准。我们报告中的数据经过FDR≤0.01的标准筛选，是可靠的数据。

对于从无标记实验中获得的定量蛋白质信息，目前还没有统一的筛选差异蛋白质的标准。如果用该标准筛选得到的差异蛋白数量较多，可根据实际情况或需要增加筛选标准，如折变> 2甚至> 4或p值< 0.01等。如果实验设计是技术重复(质谱重复分析)，建议将差异过滤标准增加至少两倍。

用于质谱分析的蛋白质数据库通常为Uniprot、NCBI等公共蛋白质数据库或客户提供的自建氨基酸序列库(需采用Fasta标准格式)。因此，蛋白质鉴定表中只显示蛋白质信息，而不显示相应的基因信息，MaxQuant输出的蛋白质鉴定表只提供蛋白质注册号，而不提供蛋白质名称或基因名称。如果您需要相关的蛋白质或基因信息，您可以根据结果中“Fasta headers”条目下提供的蛋白质ID在相应的数据库网站上进行搜索。