PRM技术与蛋白质组学中常用的Shotgun方法有什么关系?
答:散弹枪和PRM是两种不同的质谱扫描方法。散弹枪是一种大规模的扫描方法，其目标是在样本中检测尽可能多的蛋白质。它通常倾向于容易检测出高丰度的蛋白质。另一方面，PRM是一种对感兴趣的特定蛋白质的扫描方法，目的是实现目标蛋白质的精确定量。
什么时候会使用像PRM这样的技术?
答:PRM允许选择性检测靶蛋白、靶肽(例如，经过翻译后修饰的肽)，从而实现目标验证和靶蛋白/肽的相对或绝对定量。经过广泛筛选后用于验证实验。
WB可以用于靶蛋白定量，为什么选择PRM?
答:两种方法确实都可以实现靶蛋白的定量。
WB是一种依赖抗体的检测方法，其效果与抗体质量和实验操作密切相关;WB是基于显色带亮度的半定量分析。目前市场上的抗体质量各不相同。许多蛋白质都没有可用的商业抗体。单克隆抗体的制备周期较长。这些因素限制了WB的有效性。
另一方面，PRM是一种抗体独立的，基于质谱的靶向定量技术。PRM具有高度的敏感性和特异性，定量范围超过4个数量级，能够实现真正意义上的蛋白质精确定量。此外，PRM的吞吐量也更高。在一次PRM实验中可以同时定量多达数十种蛋白质，这也是WB难以实现的。
PRM可以用来做什么?
答:研究工作中与蛋白质或多肽定量相关的实验可以通过PRM技术实现。例如，在定量蛋白质组学中验证某些蛋白质的变化;肽的相对定量和绝对定量;想做蛋白定量却没有抗体;蛋白质修饰位点的定量;想要同时定量多个蛋白质等，都可以通过PRM来完成。
生物样品PRM验证的技术重复是强制性的吗?
答:生物复制用于PRM验证。
MRM, PRM对于蛋白质组学观察组间蛋白质差异和蛋白质相对定量的优势是什么?
答:靶向MRM, PRM定量更准确，也可以实现蛋白质的绝对定量。
没有标准曲线可以进行PRM吗?
答:标准曲线只用于绝对量化，相对量化不需要。
在蛋白质组学结果中有多少感兴趣的蛋白质通常被选择用于PRM验证?
答:蛋白质组学结果有一定概率无法通过PRM验证，或者验证结果一致，所以建议至少有5个蛋白质。
PRM可以用于低丰度蛋白质如转录因子吗?如果蛋白质组学检测不到，是否不适合使用?
答:如果对蛋白质组进行了深度分级，仍然没有发现该蛋白质，那么PRM也很可能检测不到该蛋白质。
根据转录组数据，是否有可能从差异基因中找到相应的蛋白进行PRM验证?可行性高吗?
答:可以尝试，但能否检测到PRM取决于翻译成蛋白质后基因的丰度，以及在转录水平和蛋白质水平上表达的一致性。理想情况下，最好是在PRM验证后得到蛋白质组学结果。
磷酸化蛋白质组学是否主要分析磷酸化修饰位点和修饰水平的变化，而不分析蛋白质丰度的变化?我需要做PRM来验证蛋白质丰度吗?
答:磷酸化的蛋白质不能分析蛋白质丰度，因为多肽已经富集，会过滤掉许多未修饰的多肽。
PRM验证的必要性由研究目的决定。如果你想验证表型主要是由于一个位点的磷酸化而不是蛋白质表达水平，需要PRM来验证对应于磷酸化位点的未修饰肽的表达丰度。这将准确反映该位点是修饰水平的变化还是蛋白质整体水平的变化。
在iTRAQ完成后进行PRM是否对蛋白质有要求?
答:蛋白质的质谱数据需要工程师提前评估，以评估检测的可行性。根据经验，有些数据的可重复性较差，因为iTRAQ通常是分级的，定量原理与PRM有很大不同。我们可以根据iTRAQ结果为PRM蛋白的选择提供一些建议。
在我做了TMT量化之后，我还需要做PRM验证吗?
A:是的，目前越来越需要后期验证。
内部标准肽必须是同位素肽吗?是否可以使用外源添加的特定的未标记肽?
A:是的，比如有些样品经常用半乳糖苷酶作为内参，而且这种酶只在微生物中表达。但只能作为归一化的内部参考，不能作为标准曲线的参考。
一般建议使用相同的蛋白质样本还是不同提取的蛋白质样本进行验证?
答:这取决于实验目的的偏差。相同样本具有较高的结果一致性匹配，用于验证实验结果。不同批次的样品在科学上更合理，并用于验证生物学结论，但存在较大的不一致风险。
当蛋白质组学中存在差异时，PRM验证后是否没有差异或相反表达?
A:这是可能的。大规模筛选非靶向蛋白存在一定的假阳性率，定量结果不如PRM准确。
我们如何确保肽不会有缺失的切割位点?
答:只能从预实验结果中确定，不能从理论序列中确定。
