凝胶蛋白鉴定一般需要多少蛋白质?
答:现代质谱仪和色谱仪的检测灵敏度非常高。只要蛋白质斑点能被肉眼清晰地看到(包括银斑)，就足以进行蛋白质鉴定。但是，为了提高质谱的成功率，需要照顾更大的凝胶范围，并尽可能多地取清蛋白斑点。
在蛋白质水解溶液中常用的试剂是什么?每种试剂的作用是什么?
答:常用的蛋白水解溶液试剂有尿素、硫脲、CHAPS、DTT、IPG缓冲液等。尿素和硫脲是释放剂(变性剂)。
高浓度的尿素和硫脲可以破坏蛋白质分子之间形成的氢键，防止蛋白质在迁移过程中氢键引起的蛋白质聚集和二级结构的形成。
CHAPS是一种两性表面活性剂(洗涤剂)，可溶解疏水性基团，提高蛋白质在其pI值处的溶解度。
IPG缓冲液的主要成分是一种具有离子性质的载体两亲电解质，它可以使某些需要在盐离子存在下溶解的蛋白质更容易溶解。
为什么进行加压主动水化时电流为零?
答:一般加压活水化时，添加的电压很低(约50V)，胶黏条电阻比较大，导致电流小于1uA，低于仪器的最小显示值，所以电流显示为零(其实是有电流痕迹的)。当后续电压逐渐增大时，电流也会逐渐增大并显示出来。另外，如果一开始电流为零，从另一个角度来看，也说明样品中的离子含量比较低，一般可以顺利进行后续的等点聚焦过程。
为什么等电聚焦时电压不上升?
A:等电聚焦的电压无法上升到规定值，主要是样品中的离子含量过高，导致凝胶导电性强。为了解决这一问题，可以通过适当修改提取方法，采用膜过滤和丙酮沉淀等策略来降低样品中的离子含量。在等电聚焦前的步骤中使用盐桥接以及缓慢加压也可以去除多余的盐离子。
双向电泳图中垂直拖尾的原因是什么?
答:出现竖纹的原因有很多，引起的现象也各不相同。例如，没有被SDS充分包被的蛋白质引起的水平条纹可以在整个区域内出现，可以通过延长平衡时间和精确配置溶液来解决;不正确的pH值Tris-HCL也会造成垂直条纹，出现雨，并在上方中心有明确的分界线，可以通过准确配置pH值来解决。此外，样品中杂质的存在，如DNA，也会造成划痕。
双向电泳图中为什么会出现横向条纹?
答:不完全聚焦和过度聚焦都会产生横条纹。不完全聚焦会导致水平条纹更粗更模糊，而过度聚焦会导致水平条纹更细更清晰。
样品中的杂质也会导致交叉条纹。
我可以直接在2D中运行凝胶，而不将其转移到另一个电泳罐后，严重的气泡膨胀?
A:一般来说是有可能的。但是，当样品体积很大时，有些蛋白质可能无法被胶条吸收，所以在运行1D和2D胶水后会出现大量的水平条纹。在这种情况下，最好将胶条重新浸泡膨胀后转移到另一个电泳槽中进行电泳。
为什么我在等电聚焦前加入的矿物油在聚焦后会减少，露出凝胶条的背面?
答:这是因为BioRad的电泳浴有一个盖子。为了将凝胶条固定在电泳槽中，该盖上有相应的凸起，设计用于固定凝胶条。由于虹吸作用，该突出物将矿物油引导到相邻的空电泳槽，从而用凝胶条降低槽内矿物油的液位。如果凝胶条暴露在空气中，对等电聚焦的影响将是毁灭性的。为了防止这种情况发生，可以在相邻的空电泳槽中添加适量(满80%)矿物油。
运行第一维时，为什么为电流设置最大电压(50 μ/凝胶)?
A:电流的平方与功率成正比。随着电流增大，功率增大，释放的热量增加，导致胶条温度升高。当温度超过30℃时，缓冲液中的尿素会趋于解离并产生一些极性分子，从而对等电聚焦产生影响。
运行第一维时，为什么电压一开始很低，然后逐渐升高?
A:一开始，体系中带电荷的小分子较多(如无机盐、双极性分子等)。在这个阶段，电流主要是由这些小分子的运动产生的。这些分子质量小，不需要高电压来移动它们。当这些小分子移动到目的地(无机盐移动到相反极性的电极，两亲体移动到相应的pH带)时，系统中的蛋白质开始承担携带电流的任务，并逐渐移动到相应的pH区域。
当运行第一个维度时，为什么它会产生一个逐渐向酸性一端移动的蓝色带?
答:蓝色条带是缓冲液中溴酚蓝被聚焦后产生的。溴酚蓝也是pH值指示剂。当它移动到酸性区域(pH值4)时，颜色变成黄色。溴酚蓝的运动大致发生在极性小分子聚焦之后，蛋白质大分子聚焦之前。
为什么运行第一个维度时电压总是达不到预定值?
答:当样本量比较大或系统盐分较多时，有可能聚焦电压达不到设定值。
在一维运行时，为什么电压达到预定值后电流会下降?
答:当上样体积相对较小时，所有蛋白质在相对较短的时间内移动到相应的pH面积值，从而成为中性分子。系统的电阻越来越高，在恒压下电流越来越小。
运行第一个维度时，为什么两个电极丝附近会产生气泡?
A:当电聚焦结束后，所有的蛋白质都移动到相应的pI值区域，成为中心分子。然后，施加到系统上的电压开始电解水分子，在阳极产生氧气，在阴极产生氢气。
硫脲在补液缓冲液中的作用是什么?双极分子的作用是什么?
答:硫脲的作用是增加蛋白质的溶解度，尤其是碱性蛋白质。双极分子的作用还在于增加蛋白质的溶解度。当蛋白质移动到相应的pH值时，它就变成了中性分子。不带电的蛋白质分子倾向于聚集，从而降低了它们在随后的非对映凝胶过程中的迁移效率，这可能导致垂直脱尾。硫脲和双极小分子将识别中性蛋白质之间的相互作用，并防止它们聚集。
如何估计二维凝胶上蛋白质点的分子量和pI值?
答:校准可以用BioRad公司的2D凝胶标准蛋白进行，也可以用系统中已知的蛋白进行比较。
为什么二维凝胶上的蛋白质斑点会出现水平和垂直的偏移?
答:水平偏移可能是由于1)不完全等电聚焦，2)某些蛋白质本身(糖蛋白)，3)蛋白质丰度过高。
垂直尾砂可能是由于蛋白质在双向运行时溶解性差造成的。
哪些成分会影响2D凝胶的效果?
答:核酸、盐、洗涤剂等。
2D凝胶的样本量应该是多少?
A:样品体积取决于样品。如果样本中有很多蛋白质，样本量应该更大，以便每个点都有足够的蛋白质被检测到。对于典型的全细胞裂解系统，样本量应在100µg(银染色)和500µg (koil染色)之间。
