材料:
- ELISA板
- 涂层缓冲液(碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液)
- 阻断缓冲液(如含1-5% BSA或牛奶的PBS)
- 一级捕获抗体(在涂膜缓冲液中稀释)
- 样品缓冲液(如含有0.05% Tween-20和1-5% BSA或血清的PBS)
- 待测样品(在样品缓冲液中稀释)
- 检测抗体(偶联酶，在样品缓冲液中稀释)
- 基板溶液(如TMB或ABTS)
- 停液(如1N HCl或1M硫酸)
- 标仪
协议:
1.包被ELISA板:
- 在包被缓冲液中稀释一抗捕获抗体至适当浓度(通常为1-10µg/mL)，每孔加100µL至ELISA板。
- 在4℃下孵育一夜或在室温下孵育2小时。
2.挡板:
- 丢弃涂膜缓冲液，用洗涤缓冲液(如含0.05% Tween-20的PBS)清洗板3次。
- 每孔加入200µL阻断缓冲液，室温孵育1-2小时。
- 丢弃阻塞缓冲液，用洗涤缓冲液清洗3次。
3.添加样品:
- 将样品在样品缓冲液中稀释至适当浓度。
- 每种样品各取100µL加入相应的孔中，室温孵育1-2小时。
4.添加检测抗体:
- 将检测抗体在样品缓冲液中稀释至适当浓度。
- 每孔加入检测抗体100µL，室温孵育1-2小时。
5.添加衬底:
- 根据制造商的说明准备基材溶液。
- 在每个孔中加入100µL底物溶液，在室温下避光孵育推荐时间(通常为10-30分钟)。
6.停止反应:
- 在每孔中加入50-100µL停止溶液(取决于所使用底物溶液的体积)以停止反应。
- 在适当的波长(通常是450 nm或405 nm)使用微孔板阅读器测量吸光度。
注意:孵育时间和温度可能需要针对每组抗体和样品进行优化。重要的是要避免污染和使用适当的移液技术。如果使用多孔板，使用板式离心机进行洗涤步骤可能会有所帮助，以确保完全去除缓冲液。
