为了在UHPLC-MS/MS分析中获得准确可靠的结果，优化样品制备工艺至关重要。强烈建议使用10%的甲醇-水进行提取，因为它确保了感兴趣的化合物的溶解度，并最大限度地减少了亲脂色素或其他干扰化合物对样品的污染。样品纯化过程在决定最终分析的灵敏度方面也起着关键作用。仔细选择和验证样品纯化方法以确保其去除干扰化合物和达到所需灵敏度的有效性是很重要的。方法的彻底验证是必要的，包括评估至少七个关键参数，如方法选择性、灵敏度、提取回收率、基质效应、线性、准确度和精密度。通过对样品制备和验证工艺的优化，研究人员可以在UHPLC-MS/MS分析植物代谢物时获得可靠、稳健的结果。
1植物激素分析取样
(a)用研钵和杵在液氮下将冷冻的植物材料磨成细粉。
(b)将20 - 25mg新鲜重量的样品单独转移到2.0 mL安全锁定微离心管中(每个样品至少重复三次)。
(c)提取样品前，立即将植物组织冷冻在液氮中，并在-80℃下保存不超过几周。
2胁迫相关植物激素的提取
(a)将-80℃的冷冻样品放入碎冰浴中。
(b)每根微离心管中加入1.0 mL冷冻萃取液。
(c)将2 mm的铈稳定氧化锆珠(共4颗)与10 μL IS混合物一起放入每个管中。
(d)将微离心管置于振动磨头机的预冷盒中，以27赫兹的频率均匀化3分钟。
(e)在37 kHz的预冷超声浴中对均质样品进行3分钟的超声处理。
(f)在4℃的台式实验室旋转机上提取样品30min。
(g)在4℃下，14000 × g离心10min。
(h)将样品提取物的上清液收集到新的2.0 mL微离心管中，置于碎冰浴中。
将剩余的颗粒放在冰上，以便进一步提取。
(i)将微球溶解于1.0 mL的冰冷提取液中，涡旋10 s，与之前一样离心(步骤g)，重新提取样品。
(j)将一个样品的上清液放入新的2.0 mL微离心管中。
非选择性固相萃取法纯化样品
(a)在将样品装入SPE Oasis®HLB柱之前，用1ml 100%甲醇进行吸附剂调节，随后用1ml 0.1%甲酸-水(v/v)进行平衡。
(b)将样品提取液(~ 2ml)加到SPE柱上。丢弃流经部分。
(c)用1ml萃取液洗涤去除干扰化合物。丢弃流经部分。
(d)将干净的玻璃管插入管架，然后用2ml 80%甲醇(v/v)从柱中洗脱样品。
(e)将收集的馏分在温和的氮气流下蒸发至干燥。
(f)在-20℃保存干燥的样品提取物，直到LC-MS /MS分析。
植物激素代谢物分析
(a)将样品溶解于40 μL 10%甲醇中，置于温度控制系统为4℃的自动进样器中。
(b)采用UHPLC-MS/MS分离检测JA及其生物合成前体和氨基酸偶联物、SA、ABA、IAA及其代谢产物。
(c)将每种样品10 μL注入ACQUITY UPLC®CSH C18色谱柱(1.7 μm, 2.1 × 100 mm)。
(d)用洗脱液(A)乙腈和洗脱液(B) 10 mM甲酸水溶液组成的28 min梯度洗脱样品，流速0.4 mL/min，柱温36℃，二元线性梯度:0 min, 15:85 (A:B);5.0分钟，15:85 (A:B);15.0分钟，45:55 (A:B);22.5分，47:53 (A:B)。
(e)梯度结束时，用100%甲醇洗涤1.5 min，调整至初始条件4.0 min。
(f)通过前体的多重反应监测(MRM)确定与胁迫相关的植物激素[M+H]+并根据被分析物的保留次数选择合适的产品离子。
(g)运行所有校准溶液并为每种分析物构建校准曲线。
(h)使用适当的质谱分析软件处理所有数据，并使用稳定同位素稀释法确定每种植物激素的浓度。
参考
- António, C.(编)。(2018)。植物代谢组学:方法和方案。胡玛纳出版社。