除非另有规定，所有程序均在室温下进行。
1组织制备和脂质提取
a)解剖视神经，切除视神经周围的脂肪层。将视神经组织样本加入冷冻瓶中，并用电天平测定组织的总重量。
b)在-80°C(或液氮)和40°C(水浴)之间交替进行5次冻融循环，破坏组织膜。
c)用剪刀将视神经组织切碎60秒。切碎后，用氩气冲洗小瓶，并将组织样品放在一边。
d)视神经组织样品中加入400 μL甲醇/氯仿(1:1)。
e)用匀浆器处理组织120秒。
f)在样品中加入350 μL氯仿，再上均质机30s。关闭管子，旋涡45秒。
g) 10000 × g离心两次，15min。观察样品和两层-上层(含水)和下层(有机)。如果两层不明显，旋涡管60秒，再次离心15分钟。
h)称重两个空瓶，标记为蛋白质和脂质。用移液管将顶部的部分移到小瓶标记的蛋白质中，将底部的部分移到小瓶标记的脂质中。将蛋白质瓶放在一边。用氩气冲洗脂管。
i)将氯仿管放入高速真空中。在室温下加热90分钟。90秒后观察试管，如果仍有液体存在，加热15分钟直到所有试管都干燥。称一下管子的重量。用氩气冲洗，保存在-80°C，直到用于质谱仪。
2气相色谱质谱分析
使用安捷伦CP-Sil 8 CB色谱柱，以超高纯度氦气为载气，流速为1.2 mL/min。实验条件为:进样温度和进样量为1 μL。初始烘箱温度为100°C 4分钟，以10°C/分钟的速率上升到318°C，并在318°C下保持6分钟，总运行时间为31.8分钟。
2.1脂质标准品的制备
a)血脂标准品，如胆固醇和胆固醇d7分别运行，以确认气相色谱的效率，以获得适当的光谱。通常，这些标准在氯仿中的浓度在50 ~ 100 μL之间。
b)这些标准溶液通过GC-MS运行5次，以确保重现性。
c)为了定量目的，通过运行不同浓度的胆固醇和胆固醇- 7溶液得到校准曲线。
2.2脂质样品的制备
a)将步骤1中子目1中干燥的脂质样品用100 μL氯仿重悬。
b)在脂质样品中加入50 μL内标(100 picoM的Cholesterol d7)进行定量。定量是通过比较光谱中胆固醇d7的峰面积和其他峰来确定的。
参考
- Sanjoy K. Bhattacharya。(2019)。代谢组学:方法和方案。斯普林格出版社。