总膜蛋白n -糖基化分析方案在线调查

1利用Triton X-114分离膜蛋白

1.1 Triton X-114相位划分

(a)为了获得细胞裂解液，大约400万个细胞在含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒的Triton裂解缓冲液中均质，以防止蛋白质降解。使用超声波处理均质，然后将样品在4℃下孵育1小时。为了得到清晰的裂解物，然后在4°C下10,000 x g离心30分钟。

(b)将得到的透明上清液覆盖在蔗糖垫上，在37℃下孵育20分钟，得到浑浊溶液。然后将样品在400 x g和37°C下离心3分钟，形成两相，富洗涤剂相和水相贫洗涤剂相。

(c)将水相转移到一个新的管中，并将其放在冰上。

(d)在500 μL冷PBS中重悬洗涤剂相，再次重复相分离。将该水相与初始水相混合，加入50 μL Triton原液重新提取，进行相分离。

1.2蛋白质沉淀

由于Triton X-114的存在干扰了N -糖苷酶F的酶解糖基化，N -糖苷酶F是一种酰胺酶，也称为PNGase F，它在N -聚糖的最内层GlcNAc和蛋白质上的天冬酰胺残基之间分裂，因此必须在聚糖分析之前将其去除。最好的方法是用有机溶剂沉淀。选择的方法如下所述，是氯仿-甲醇-水沉淀法。

(a)在每个样品和漩涡孔中加入四倍于样品体积的甲醇。

(b)依次向每个样品中加入两倍于初始样本量的氯仿，旋涡孔。

(c)最后加入初始样本量的三倍水，大力涡旋，在4℃下9000 × g离心1 min。离心后，蛋白质位于液间相。

(d)除去上层水层，再加入3体积甲醇，涡旋样品，在9000 × g, 4℃下再次离心2分钟，使蛋白质成球。

(e)在不干扰沉淀物的情况下尽可能地去除上清，并使样品风干。

2用HILIC-UPLC或HPLC分析n -链聚糖

2.1聚糖释放和标记

(a)加入30 μL 1.33% SDS (w/v)重悬微球，65℃孵育10 min。

(b)随后，在每个样品中加入10 μL 4% Igepal-CA630和1.25 mU PNGase F，加入10 μL 5倍PBS。在37°C下孵育样品过夜，以释放N -聚糖。

(c)现在按副标题b所示准备标签混合物。准备该混合物时务必保持新鲜。

(d)每个样品加入25 μL标记液，65℃孵育2 h。

(e)每个样品加入700 μL ACN，使其达到96% ACN (v/v)。

(f)制备0.2 μm GHP 96孔滤板。为此，您需要用200 μL 70%乙醇(v/v)和200 μL水预洗板，然后用200 μL 96% ACN (v/v)平衡。

(g)用多通道移液器将样品转移到制备板上。用真空除去溶剂。

(h)用200 μL的96% ACN (v/v)洗涤5次，按照副标题2(在真空歧管上制备滤板)中所述的上样和去样程序进行。用2 × 90 μL的水洗脱聚糖，保存于- 20°C，待色谱分析。

2.2亲水性相互作用液相色谱(HILIC)-UPLC/HPLC

在荧光标记后，n -聚糖可以通过UPLC或HPLC亲水性相互作用色谱分离，荧光检测器分别设置在250 nm和420 nm的激发波长和发射波长。对于UPLC，在BEH聚糖色谱柱上进行分离，线性梯度为75-53%乙腈和100 mM甲酸铵，pH为4.4，分别作为溶剂a和B。运行时间为25分钟，进样前样品保持在5℃。高效液相色谱柱为TSKgel Amide 80，线性梯度为65-53%乙腈和50 mM甲酸铵(pH 4.4)，分别作为溶剂a和B。运行时间为60分钟，色谱柱保持在30℃。在这两种情况下，将色谱面积集成以确定每个峰中聚糖的数量，其表示为总集成面积的百分比。

参考

1. Lauc, G.， & Wuhrer, M.(2017)。高通量糖组学和糖蛋白组学。纽约斯普林格出版社。