1.细胞的制备
DDF可用于分离生长在液体悬浮液或平面上的细胞。DDF后，所有提取物应在-70°C冷冻保存。部分DDF缓冲液应保存在-70°C，用于样品的归一化，并作为酶和蛋白质分析的对照材料。为避免培养基的影响，在DDF之前，细胞应在无洗涤剂缓冲液、冰盐水或PBS中清洗两次。
1.1.悬浮细胞
1)对于在液体悬浮液中生长的细胞，DDF溶液的体积由湿重或细胞计数决定。为了确定湿重，应将液体培养样品转移到预先称重的塑料管中并短暂离心。
2)除去培养基后，测定细胞颗粒的湿重。洋地黄苷/EDTA萃取缓冲液(5体积/g湿重)可直接加入到细胞颗粒中。
1.2.Monolayer-Cultured细胞
1)在平面上生长的细胞的DDF缓冲液的体积由表面积或细胞计数决定。对于一个典型的T25培养瓶(约5 × 106细胞)，初始使用1ml洋地黄苷/EDTA缓冲液。
2)除去培养基后，在培养瓶中进行DDF。
2.洗涤剂分馏
2.1.洋地黄苷提取(胞浆萃取)
1)在洗涤后的细胞微球(轻轻旋转重悬)或单层(1ml /T25烧瓶)中加入冰凉的洋地黄苷提取缓冲液(5体积/g湿重)。
2)将细胞在冰上温和搅拌(平台搅拌机)孵育，直到95% - 100%的细胞渗透(5-10分钟)，通过台盼蓝排除测定。
3)对于液体悬浮培养的细胞，将提取液(480g)离心，去除上清。
4)对于单层细胞，倾斜培养瓶，用移液管除去提取液(胞质蛋白)。记录提取液体积，等分，-70℃保存。
2.2.Triton X-100萃取(膜/细胞器萃取)
1)小心地将洋地黄苷不溶性微球重悬于冰冷的Triton X-100萃取缓冲液中，其体积与洋地黄苷萃取液的体积相当(相对于起始湿重为5伏)，以获得均匀的悬浮液。
2)对于单层培养物，每T25烧瓶加入1ml Triton萃取缓冲液(约5 × 10)6细胞)。
3)在冰上温和搅拌(平台搅拌机)孵育30分钟。
4)通过离心悬浮液(10分钟，5000g)或倾斜和滗析单层来去除Triton提取物(膜和细胞器蛋白)。
5)测量提取液体积，等分，-70℃保存。
2.3.吐温/DOC萃取(核馏分)
1)将悬浮培养的Triton不溶性微球重新悬浮在Tween/DOC萃取缓冲液中，体积为Triton萃取体积的一半;用聚四氟乙烯光滑壁玻璃均质器(五冲程，中速)重悬液。
2)用抗洗涤剂残留物(6780g)成球去除Tween/DOC提取物(核蛋白)。
3)用0.5-1 mL Tween/DOC缓冲液每T25烧瓶等效提取细胞单层。
4)记录体积，等分，-70℃保存。
2.4.耐洗涤剂残留物(细胞骨架/核基质部分)
1)耐洗涤剂颗粒在冰冷的PBS (pH 7.4, 1.2 mM PMSF)中洗涤，通过重悬(特氟龙/玻璃均质机)和离心(12,000g)进行机械剪切DNA。
2)悬浮培养的微球用-20°C 90%丙酮洗涤一次，冻干，在涂了油的Eppendorf离心管中测定重量。样品保存在-70°C。
3)对于单层，耐洗涤剂残留物用PBS冲洗，直接悬浮在不含β-巯基乙醇的非变性细胞骨架(CSK)增溶缓冲液中，滴定，保存在-70℃。
3.蛋白质的测定
1)将洗洁精缓冲液和洗洁精萃取液等分液放在冰上解冻。
2)用4伏超纯水稀释洋地黄苷和Triton X-100提取物的等比(从单层培养中获得的提取物可能需要较少的稀释)。吐温/DOC提取物不稀释使用。
3)将冻干的CSK微球溶于不含β-巯基乙醇的CSK增溶缓冲液中(干重10mg /mL)。必要时稀释单分子层的CSK制剂。
4)采用彼得森福林-酚法，从每个馏分中取20-50 μL稀释或未稀释的样品，一式两份。
5)用烘箱干燥的牛血清白蛋白制备每种洗涤剂缓冲液，生成标准曲线。
4.二维凝胶电泳分析
从各种细胞类型获得的DDF样品可以在等电聚焦(IEF)和非平衡pH梯度电泳(NEPHGE)下用于二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。在比较之前，将样品归一化，使其在等体积中含有相等的蛋白质。
4.1.样品制备
1)将新鲜或解冻的DDF样品放在冰上保存。
2)将洋地黄苷、Triton X-100、Tween-40/DOC提取物的样品加入固体尿素，加入9.5 M尿素。
3)加入85 mg尿素和15 μL 10X O’farrell裂解缓冲液后，将100 μL样品加热至室温。
4)将干燥后的CSK提取液直接溶解于1X O'Farrell裂解缓冲液中。
5)对于不还原性SDS缓冲液中的CSK提取物，加入固体尿素至9.5 M，加入10X裂解缓冲液。
4.2.样本归一化
用于比较的样品在加入裂解缓冲液或尿素之前，通过使用适当的洗涤剂提取缓冲液进行体积归一化，将蛋白质浓度归一化。
4.3.二维电泳
用已建立的方法对DDF样品进行二维凝胶电泳。IEF凝胶共含有3.5%的双酚类(2% pH 5.0-8.0, 1% pH 3.0-10.0, 0.5% pH 2.0-5.0)，样品电泳共9800 V-h，最后一小时在800 V下超聚焦。NEPHGE凝胶含有2% pH 3.0-10.0的碱，样品电泳2400 V-h。
参考
- J. M.沃克(主编)。(2005)。蛋白质组学协议手册。胡玛纳出版社。