1亲和纯化
(a)在15ml试管中自旋2ml ProtG珠(3000 × g, 10s)。
(b)小心地将上清液从珠上移出。
(c)向微球中加入2ml PBS。
(d)彻底旋转，重复旋转，去除上清。
(e)用4.67 mL PBS重悬珠。
(f)使用200ul。多通道移液器，将50 uL浆液应用于96孔滤板的每孔。
(g)使用真空歧管，用200 uL PBS清洗珠三次。
(h)加入100 uL PBS，留在珠上。
(i)加入2ul血清或血浆。
(j)将滤板放在聚丙烯96孔v型底板上，用胶带封好孔。
(k)滤板在摇板机上1000rpm孵育1h。
(l)使用真空歧管，用200 uL PBS洗涤样品三次。
(m)使用真空歧管，用200ul的MQ清洗样品三次。
(n)从真空集管上取下滤板，在无绒纸上小心地轻拍底部，去除多余的液体，将滤板放在新的96孔聚丙烯底板上。
(o)在每孔珠中加入100ul 100mm甲酸，并用胶带密封。
(p)在摇板机上1000 rpm孵育5分钟。
(q)取下胶带，100 × g离心1分钟，洗脱滤板上的igg。
(r)使用真空浓缩器在60°C下干燥样品以完成干燥，大约需要2-3小时。
(5)样品可直接消化或用胶带密封保存于- 20°C。
2纯抗体样品的变性
(a)在100 mM FA溶液中加入任意体积的5 μg抗体(样品)，但保持最低终浓度为75 mM FA。漩涡。
(b)室温孵育15分钟(RT)。
(c)在设置为60°c的离心真空浓缩器中干燥，直至完全干燥。
3蛋白酶处理
(a)加入40 μL (1 μg) TPCK处理过的胰蛋白酶溶液。在摇床上以RT和低转速(例如400 rpm)孵育5分钟。
(b) 37℃孵育18h。
(c)样品可以在冷却的(4°c)自动进样器中短期保存，也可以在- 20°c下长期保存
4质
(a)将250 nL样品注入25 μL/min的溶剂a流速中，在捕集柱上捕获糖肽。
(b)切换到900 nL/min的梯度泵流量，将糖肽洗脱到分析柱上进行分离。陷阱和分析柱都保持在30°C。溶剂B浓度的变化呈线性梯度。
(c)雾化和电离是在CaptiveSpray™ESI源中由来自nanoBooster™的acn掺杂雾化气体辅助实现的。
(d)使用高度优化的离子转移设置，糖肽以高效率和最小的碎片(与预期的母峰相比，在0.1%至1%之间)解簇和解离。
(e)在5分钟的分析期间，在全谱分析模式下每秒获取MS谱，质量范围为m/z 550 ~ m/z 1800。将质谱数据保存为剖面谱是保证准确的质谱测定和质谱峰面积积分定量的关键。由于同一IgG同种异构体的不同糖型经常共洗脱，分离后将显示三个不同的糖肽“簇”。
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参考
- Lauc, G.， & Wuhrer, M.(2017)。高通量糖组学和糖蛋白组学。纽约斯普林格出版社。