1糖蛋白变性
(a)将每份样品5 uL的等分血浆(或血清)分配到96孔v底PP板中(见注释2和3)。
(b)加入变性溶液(每孔55 uL, 100 mM碳酸氢铵，12 mM DTT)，将板盖上，放在机器人加热摇床上，在65°C下以700 rpm搅拌30分钟。
(c)静置10 min，加入碘乙酰胺溶液(每孔10 uL,120 mM)，盖防蒸发盖，室温下700 rpm搅拌30 min。
(d)加入胰蛋白酶溶液(每孔40000 U/mL溶液10 μL)，用箔封盖板，置于机器人加热摇床上，37°C, 700 rpm搅拌120 min。然后，将温度升高到105°C，继续孵育10 min。
(e)将板材冷却至室温，短暂旋转，并取下密封件。
2 n -聚糖释放
(a)为了从糖蛋白中释放聚糖，制备PNGaseF溶液(0.5 mU, 1.0 M碳酸氢铵)。
(b)加入PNGaseF溶液(10 μL)，用防蒸发盖密封，37℃搅拌，700 rpm, 120 min。
肼介导的聚糖清除
(a)用100 μL MeOH洗涤96孔化学惰性滤板。
(b)每孔中加入40 μL水悬液Ultralink肼树脂。
(c)用甲醇(200 μL)、H2O (200 μL)和MeCN (200 μL)。
(d)将膜板置于加热器(80°C, 10分钟)上密封。
(e)在树脂(180 μL)中加入mecn -乙酸(98:2)，然后加入20 μL的聚糖溶液(用PNGaseF释放的聚糖，剩余的聚糖样品作为储备)。
(f)过滤板在80℃下，700 rpm摇温60 min。
(g)在树脂(50 μL)中加入mecn -乙酸(98:2)，在相同温度(80℃)下持续振荡10 min，以破坏树脂聚集体。
(h)依次用MeOH(每孔2 × 300 μL)、2.0 M胍(2 × 200 μL)、h2o (2 × 200 μL)、三甲胺- MeOH (1:99, 2 × 200 μL)、MeOH (2 × 200 μL)洗涤树脂。
(i)加入新鲜的MeOH (180 μL)和乙酸酐(20 μL)，在室温下700 rpm搅拌30 min。
(j)过滤去除多余的试剂，用MeOH、h2o和MeCN (400 μL)依次洗涤树脂珠。
(k) men -乙酸(98:2,175 μL)2依次加入O (25 μL)，在70℃下搅拌，700 rpm下孵育90 min。
4荧光标记
(a)每孔配入2-AB荧光标记混合物(50 μL, 350 mM 2-氨基苯甲酰胺，1.0 M氰硼氢化钠醋酸-二甲亚砜(30:70))。
(b)在65°C下以800 rpm搅拌120 min。
(c)加入400 μL men - h2o(95:5)猝灭标记反应。
5聚糖固相萃取
(a)将2- ab标记后的悬浮液转移到2 mL的收集板上，静置微珠，吸取200 μL上清液，再分配回过滤板。
(b)将悬浮液混合几次后转回2ml收集板。重复此循环一次，以确保树脂的定量转移。
(c)用1ml men - h洗涤HyperSep Diol固相萃取筒20 (95:5)， 1ml H2O和1ml MeCN-H2O(95:5)。
(d)将淬灭反应混合物的上清液转移到SPE (900 μL)筒中。
(e)通常5分钟的孵育可使溶剂完全排出。
(f)用750 μL men - h洗涤三次2O(95:5)去除多余的2-AB。
(g)在机器人真空歧管内放置收集板，在200 μL H的真空条件下洗涤固相萃取筒2O /MeCN(80:20)，间歇孵育5分钟，以洗脱固相萃取筒上保留的聚糖。
(h)糖聚糖洗脱后，样品在真空蒸发器中浓缩至干燥。
6 HILIC-FLD-UHPLC
1.为UHPLC分离准备新鲜溶剂:溶剂A (50 mM甲酸铵溶液，pH 4.4)和溶剂B (MeCN)。
2.建立UHPLC系统:准备系统，连接色谱柱，打开荧光检测器。
3.在Empower软件中设置仪器方法，流速:0.56 mL/min，线性梯度为70 - 53%的MeCN，分离运行30 min; t = 0 min, 70%溶剂B;t = 24.81 min, 53%溶剂B;t = 25.5 min, 30%溶剂B和t = 26.55 min, 70%溶剂B。
4.调整荧光检测器的设置:激发波长330 nm，发射波长420 nm，数据单位:发射，数据速率:2 pts/s, PTM增益20.0。
5.做一个H的空白样本2O。
6.运行2-AB标记的葡聚糖阶梯(标准品)，将样品溶解于30 μL men - h中2O(70:30)。
7.运行感兴趣的样品，用men - h将2-AB标记的聚糖样品的体积调至30 μL2O(70:30)。
你可能感兴趣的是:
参考
- Lauc, G.， & Wuhrer, M.(2017)。高通量糖组学和糖蛋白组学。纽约斯普林格出版社。