非靶向串联质谱联用超高压液相色谱法鉴定脂质方案在线调查

1脂质提取

一系列脂质提取方法已在科学文献中记录，包括Folch和Bligh和Dyer方法，以及MTBE。本协议概述了Bligh和Dyer方法的修改版本。

为了尽量减少样品处理过程中的不饱和脂质氧化，通常在脂质提取之前添加抑制剂的混合物。这些抑制剂，如乙二氨基四乙酸(EDTA, 2 mM终浓度)和丁基羟基甲苯(BHT, 100 μM终浓度)，起到螯合剂的作用。

为了防止脂肪酶活性，组织样品应在液氮中快速冷冻，并在脂质提取之前尽可能少地处理，例如在称重期间。

当处理细胞微球时，它们可以直接提取，以避免脂质成分的进一步变化，并且得到的干脂质样品可以在氩气下储存在- 80°C直到分析。

脂质样品(例如，100mg快速冷冻组织匀浆或1 × 10⁷细胞悬浮在500 μL缓冲液中)，与等体积的甲醇混合，旋涡1分钟。然后用氯仿(通常以与缓冲液加甲醇相同的体积)提取，此过程重复三次。

由于塑料容器中的增塑剂会污染脂质样品、高效液相色谱柱和质谱仪，只能使用玻璃管或小瓶，Hamilton注射器或玻璃移液器为佳。

每次提取后，混合物在3500 RCF下4°C离心10 min，分离有机相和水相。将较低的氯仿相结合并蒸发至干燥，通常使用氮气蒸发器。

然后将氮气转换成比空气密度大的氩气，以确保样品被密封在氩气包层下。辅助膜可用来密封小瓶。该提取程序可用于悬浮细胞、细胞颗粒或均质组织。

2脂质色谱分离:高效液相色谱法

由于其结构的多样性，脂质具有不同的化学性质和极性，单一的脂质分离系统是具有挑战性的。色谱分离方法的示例包括在反相C18柱上使用作为缓冲系统的HPLC或UHPLC;a - 10mm醋酸铵或甲酸铵溶液在40%乙腈中溶于水，作为缓冲液b - 10mm醋酸铵或甲酸铵溶液在10%乙腈中溶于异丙醇。典型的27分钟分离方法，可实现脂类分离和部分物种分离。

3脂质分析仪器采集方法

多种仪器可用于质谱检测脂质。然而，通常使用串联质谱计，它可以获得全质谱，对最强烈的脂质离子进行片段化，并获得被测脂质的片段离子信息。最流行的脂质分析仪器是Orbitrap (Q-Exactive, Orbitrap Fusion)和Q-TOFs (Agilent, Waters, Sciex, Bruker等)。三重四极杆仪器通常用于特定脂质的针对性分析。

4数据分析

有几个软件包可用于脂质鉴定和定量的质谱数据分析，如脂质搜索(Thermo Fisher)， Lipidblast, sim脂质(Premier Biosoft)。将MS/MS实验数据与来自不同数据库的光谱进行匹配，从而提供鉴定。从历史上看，由于缺乏MS/MS数据库，这曾经是基于精确的大规模搜索来完成的。目前，结合母体离子的精确质量，与实验或计算机数据库进行MS/MS匹配是首选的鉴定方法。

参考

1. Bhattacharya, s.k.(2017)。Lipidomics。分子生物学杂志，2009。