使用液相色谱高分辨率串联质谱法对哺乳动物细胞、血浆和组织进行脂组学工作流程的协议在线调查

在Folch脂质提取过程中，所有的样品和溶剂都应保存在冰上。避免将样品暴露在室温下超过5分钟。

1样品制备

a)制备哺乳动物细胞，在15ml锥形管中，在311 × g下，4℃下离心5min。用1ml细胞冲洗液清洗细胞颗粒，重复此过程2-3次。在最后的洗涤步骤中，在冲洗溶液中重构细胞，每次检测获得5 μL的等比液。细胞颗粒可在- 80°C下保存或进行脂质提取。

b)在冰上解冻血浆样品，将40 μL移液管至2.0 mL离心管中，然后进行Folch提取。在整个提取过程中，将样品放在冰上。

c)收集后的组织在液氮中快速冷冻，保存在- 80°c。用陶瓷杵在液氮冷却的臼中粉碎每个组织样本。将细粉称量到匀质管中，用适合组织类型的匀质珠涂抹天平。以50mg组织为目标，记录组织粉的重量，以便调整提取量。在组织中加入内标(125 μL / 160 ppm)，用Folch溶剂[氯仿:甲醇，(2:1,v:v)]匀浆，体积为组织重量(mg)的20倍。

d)使用混合样品组质量控制或标准参考物质(SRM)，如红十字血浆或NIST SRM，以确保质量控制。

2样品依赖性叶酸脂质提取

a)在血浆或哺乳动物细胞中加入脂质内标准混合物的等比物，并用空的艾氏/锥形管作为提取空白。

b)将含有1mm BHT的冷冻甲醇和氯仿(1:2,v/v)直接加入样品中。

c)在冰上孵育30分钟，偶尔进行涡旋。

d)加入冰水至氯仿/甲醇/水的最终比例(8:4:3,v/v/v)，在冰上再孵育10分钟。

e)在4℃下，以311 × g离心5min，分离水层和有机层。

f)用移液管通过水层(上相)，将有机层(下相)转移到一个单独的埃本多夫/锥形管中，而不使蛋白质层污染有机相。

g)在剩余的水层上加入再萃取溶剂，进行再萃取，在4℃下旋转离心5min。

h)在30°C氮气下干燥有机层。

i)用100%异丙醇重新配制干燥的脂质提取物。

j)用200 μL玻璃插入物将脂质提取物转移到LC小瓶中。

UHPLC-HRMS数据采集

a)创建一个仪器序列，从溶剂和萃取空白开始，为色谱柱和仪器平衡留出时间。

b)以起始百分比的溶剂A和b作为流动相，在50°C下平衡UHPLC C18柱。

c)应用以下LC梯度:0分钟32% B, 1分钟40% B，保持40% B至1.5分钟，4分钟45% B, 5分钟50% B, 8分钟60% B, 11分钟70% B, 14分钟80% B，流速为0.5 mL/min。

d)将自动进样器保持在5°C。

e)正离子模式下使用加热电喷雾电离(HESI)参数:喷雾电压3.3 kV，护套气和辅助氮气压力分别为30和5任意单位，毛细管和加热器温度分别为300℃和350℃。负离子模式下不同的HESI参数为鞘气和辅助气，分别为25和15任意单位，毛细管温度为250℃。

f)仪器校准后，使用以下全扫描MS条件并进行极性切换:35 V s透镜RF电平，分辨率为70,000，自动增益控制为5 × 10⁶离子，最大注入时间256 ms，扫描从m/z 200 - 1500。所有数据均以剖面模式获取。

g)为了鉴定，从每个样品组中收集的样品分别在两个极性上进行分析，使用交替的全扫描和全离子碎片(AIF)扫描，AIF参数如下:分辨率为70,000，自动增益控制为5 × 10⁶在步进归一化碰撞能量(NCE)分别为15、20和25的条件下，从m/z 100-1500进行扫描。

h)通过数据相关top10 (ddMS2-top10)分析，获得了混合样品中各极性离子的破碎度。离子使用1 amu窗口分离，并使用5 × 10的强度阈值触发分离⁴(设置下填比以达到该期望目标)，10-20 s的顶点触发，同位素排斥，4 s的动态排斥。离子在nce为15、20和25的条件下被HCD粉碎，碎片以35000分辨率测量，自动增益控制为5 × 10⁶离子，最大注射时间175 Ms。

4 HRMS脂质组学数据处理

a)使用ProteoWizard MSConvert等软件将.raw文件转换为mzXML输出。

b)使用特征检测和对齐软件处理mzXML文件。

c)将采集到的峰值数据导出为csv文件，可以导入进行数据分析和解释。

数据分析和解释

a)应用单变量和/或多变量统计分析软件对挑峰数据进行分析。

b)将预定义样本组之间存在显著差异的特征从特征检测和比对软件中匹配到数据库或内部库中进行标注。注释的可信度随着m/z、加合物、保留时间和碎片模式等信息的增加而增加。

参考

1. Bhattacharya, s.k.(2017)。Lipidomics。分子生物学杂志，2009。