使用HILIC-QQQ-MS/MS定量低丰度磷酸化碳水化合物的方案将您的研究提升到一个新的水平。学习如何使用亲水性相互作用液相色谱和三重四极杆质谱法检测和量化稀有和重要的磷酸化碳水化合物。深入了解健康和疾病中的碳水化合物信号，并利用这种强大的技术推进糖组学研究。
1植物生长和取样条件
为了最大限度地减少生物变异并确保植物代谢组学研究的准确性，在特定和受控的条件下种植植物至关重要。这有助于确保植物材料代表所研究的总种群。此外，建议提前准备样品鉴定文件，并预先标记所有样管，因为在一次研究中通常会产生多个样品。收获植物材料后应迅速淬火，以防止代谢物水平的变化。在均匀的新鲜冷冻植物组织中进行代谢物提取也很重要，以提高提取效率。在该过程的所有步骤中，必须防止植物材料融化，以保持样品的完整性。
2收获和组织取样
(a)用与冷冻机兼容的标签或笔标记所有样品螺旋盖聚丙烯猎鹰管(15或50毫升，取决于材料的量)。
(b)将有代表性的植物组织收获到一个螺旋盖聚丙烯Falcon管中，并在液氮中迅速冷冻(淬火)。
(c)使用装满液氮的预冷杵和研钵(或预冷球磨机)将冷冻的植物组织均匀化。在这样做的同时，要通过依次添加液氮来确保植物材料不会解冻。
(d)获得均匀的细粉后，用预冷的金属刮刀或小勺子将其转回预冷的带标签的螺旋盖聚丙烯Falcon管。
(e)使用预冷的2.0 ml safelock微离心管对50 mg新鲜重量(FW)粉末状冷冻组织等分称重。
(f)准备至少六个生物重复，并确保它们遵循相同的取样程序，以减少生物变异。
(g)将所有标记并称重的2.0 ml safelock样管保存在80℃的盒子(或塑料袋)中，直到代谢物提取和进一步的LC-MS分析。
3代谢物提取
高极性代谢物，如磷酸化碳水化合物的提取遵循一个完善的方案，使用50毫克(FW)的植物组织。
(a)每个2.0 ml的safelock微离心管中加入500 μL的冷藏代谢物提取液，该微离心管中含有50 mg (FW)的冷冻植物组织。涡流和保持管道在冰上(酶活性停止和蛋白质沉淀在这一步)。
(b)每个样管在-20℃下孵育2小时，偶尔进行涡旋。
(c)加入400 μL的hplc级冷水，在4℃，950 rpm下，将样品管置于热激振器中15 min。注意!提前打开恒温器冷却。
(d) 11000 × g, 4℃离心10min。
(e)将上相(水-乙腈)转移到新的2.0 mL safelock微离心管中，并在冰上保存。
(f)用400 μL的hplc级冷水重新提取氯仿相，按上述步骤(c)和(d)离心。
(g)将第二水-乙腈相加入第一水相。
(h)按照步骤(d)再次离心。
(i)将混合的上相(水-乙腈)转移到一个新的2.0 ml safelock微离心管中，并将其保存在冰上。
(j)使用离心式浓缩器在20℃下将水-乙腈相蒸发至干燥，最长时间为6小时。
(k)用惰性气体(氩气)填充管子，以防止干燥的萃取物通过大气成分发生氧化和降解反应。
HILIC-QQQ-MS/MS方法开发
本文描述的HILIC-QQQ-MS方法分为两部分。第一部分描述了ESI-QQQ-MS对单个标准工作溶液的直接输注测量，第二部分指导您完成HILIC-QQQ-MS方法的开发和验证。
4.1 ESI-QqQ-MS直接输注测量
4.2 hilic - qq - ms方法开发与验证
5数据分析
这里介绍了一个简单的过程，使用MassLynx软件(版本4.1,Waters®)分析LC-MS原始数据，然后使用通常的Microsoft Excel®电子表格功能。或者，用户可以使用MassLynx软件(版本4.1,Waters®)中的QuanLynx工具处理LC-MS数据。
(a)打开MassLynx以显示LC-MS数据(包括单个目标化合物和QC混合物)。
(b)在色谱图中点击查看峰形和离子强度。
(c)点击“显示”，然后点击“质量”，检查每个过渡是否存在峰值。
(d)在不同的天或周内检查分析之间的保留时间和峰值区域。
(e)打开校准曲线混合物的LC-MS原始文件，登记每种目标化合物的MRM1过渡峰面积值(表2)，构建峰面积-浓度图即校准曲线，以及每种目标化合物LOD和LOQ评价的S/N值。
(f)完成后，通过目视检查评估每个校准曲线的线性度，然后使用曼德尔拟合检验。
(g)计算保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD， %)，评价每种化合物的日内、日间精密度。
(h)为了确定方法的准确性，打开相应的LC-MS原始文件，登记峰面积，计算各自的浓度，使用式1:
(i)为了确定百分比ME(%)，打开相应的LC-MS原始文件，记录被分析物的信号响应，并使用公式2:
其中ME=100%表示无基质效应，ME<100%表示离子抑制，ME>100%表示离子增强。
参考
- António, C.(编)。(2018)。植物代谢组学:方法和方案。胡玛纳出版社。