磷酸蛋白质组研究的反相对角色谱方法在线调查

1蛋白质组和肽的制备

a)在室温下，用5ml细胞破坏缓冲液在黑暗中破坏2500万个HegG2细胞5分钟，并在冰上转移30分钟。为确保细胞充分裂解，反复涡流该溶液。

b) 13000 × g 4℃离心10分钟，丢弃含有不溶性物质的球团。

c)在两根PD-10柱上脱盐蛋白质溶液(每柱2.5 mL蛋白质溶液)，将每个脱盐后的蛋白质部分收集在3.5 mL蛋白质消化缓冲液中。

d)将两种脱盐蛋白溶液混合在一起。

e)加入40 μg胰蛋白酶，37℃孵育过夜。

f)加入1 M HCl调节肽溶液pH至pH 3。

g) 13000 × g离心10分钟去除不溶物。

h)根据制造商的方案在Fe3+负载的IMAC珠上加载磷酸肽。

i)用2ml 0.4 M的氢氧化铵从IMAC树脂中洗脱磷酸化肽。

j)将多肽混合物分成两等份(混合物A和B)，在离心真空浓缩器中干燥至完全干燥。

k)将混合物A重新溶解于50 μL犊牛肠道碱性磷酸酶(CIP)反应缓冲液中，加入10单位CIP、200单位lambda蛋白磷酸酶和0.66单位碱性大肠杆菌磷酸酶。37℃孵育1 h，加入80 μL 0.5 M KH2PO4将pH降至5。加入4 μg测序级修饰胰蛋白酶，干燥至完全干燥。将混合物A溶于150 μL H218O中，37℃孵育过夜。将180o标记的去磷酸化肽混合物转移到含有1.5 μmol三(2-羧乙基)膦(TCEP)和15 μmol碘乙酰胺的埃彭多夫管中，两者均以干燥颗粒的形式存在。在37°C的黑暗中孵育1小时，并在- 20°C保存直至下次使用。

l)对混合物B重复步骤11，但排除磷酸酶，用天然水代替H218O。

2前磷酸化肽的COFRADIC分离

a)将多肽混合物a和B混合。

b)用RP-HPLC按照表1所示的梯度对肽进行分离，并按照表2所示的方案收集初级馏分。

c)混合分离16 min的初级馏分(见表2)，干燥后再溶解于含有10单位CIP、200单位lambda蛋白磷酸酶和0.66单位碱性大肠杆菌磷酸酶的50 μl CIP反应缓冲液中。

d)在37℃下，加入40 μL HPLC溶剂A和10 μL 50 mM乙酸，脱磷1 h，停止反应。

e)在初级RP-HPLC运行时使用的相同色谱柱和相同溶剂梯度(表1)上分别折射每一池去磷酸化肽，并使用表2所示的分选方案收集已分类的去磷酸化肽(疏水移位)。

f) 6。将分选的多肽保存在- 20°C以待进一步分析。

参考

1. de Graauw, M.(2009)。Phospho-Proteomics。胡玛纳出版社。