成像质谱法样品制备和分析规程在线调查

1动物、饮食和组织收集

a) 8 ~ 10周龄载脂蛋白e缺乏(ApoE−/−)小鼠(n = 4)饲喂自由高脂饲料诱导动脉粥样硬化发展。

b)高脂饮食12周后，在麻醉下从腹主动脉抽取全血，放血。

c)过量吸入异氟醚诱导动物安乐死后摘取小鼠心脏。

d)未冲洗的心脏立即在液氮中冷冻，保存在- 80°C，直到切片时间。

e)如果必须对小组织进行包埋以支持切片，也可以将组织包埋在mOCT中。

f)制备mOCT，将5 g PVA 6-98加入50 ml，制成10% PVA 6-98溶液。

g)将溶液微波加热，然后搅拌使PVA 6-98溶解在溶液中。

h)溶液冷却至室温后，加入4ml PPG 2000和50mg叠氮化钠(NaN3)。

i)盖好并在室温下保存。

2组织准备

a)使用厚度为10 μm的冷冻刀对心脏主动脉瓣进行组织切片，最佳温度为- 20°C ~ - 27°C。

b)切片放置在涂有ito涂层的玻璃载玻片上，用细毛刷保存在- 80°C，直到需要进行IMS和/或其他分析。

c)带组织切片的载玻片从- 80°c中取出，立即放入氮气箱中进行脱水，连续扫气20分钟以去除水分。

d)使用平板扫描仪捕获组织切片的2400点/英寸(DPI)数字图像。

e)苏木精&伊红(H&E)染色也可以在同一组织的连续切片上进行，然后与ims衍生的彩色编码图像叠加。

3矩阵应用

a)自制升华室，配置真空泵、冷阱、热板和玻璃室，用于将基质沉积到组织上。

b)将组织切片用胶带粘在腔室底部，大约悬吊。在一层均匀干燥的DHB基质晶体之上2英寸。

c)调节真空压力至50mtorr，同时调节热板温度至150℃。

d)一旦压力和温度稳定，将升华室放置在充满沙子的热板上，以帮助分配热量传递。

e)通过升华将DHB基质沉积在组织切片上。

f)允许升华的总时间为7分钟。

4分析

a)使用UltrafleXtreme MALDI TOF/TOF获取分子图像。

b)仪器在反射模式下工作，产生300-1000原子质量单位(amu)的正离子。

c) DHB基质分别与肽标准品、咖啡因、氯氮平按体积比(9:1:1:1)混合。

d)将1 μL的混合物用手涂抹在不锈钢MALDI板上，晾干。

e)在开始成像实验前进行外部质量校准。

f)离子源加速电压设置为20 kV，离子源2电压为17.8 kV，透镜电压为7.0 kV，延迟提取时间为120 ns。

g)在阈值以上操作smartbeam II激光器，重复频率为2000 Hz，每个像素累积100次。

h)将激光束直径设置为10 μm，像素步长设置为10 μm，以便均匀地烧蚀整个组织表面。

i)稀释羊羊毛胆固醇和磷脂酰胆碱标准品，与DHB基质混合。

j)将1 μL标准品涂抹在不锈钢MALDI板上，晾干。

k)从质谱分析中选择一个强像素。

l)利用离子门(+/ - 2 Da窗口)进行人工采集，将目标分析物与周围信号隔离开来。

m) FlexImaging ver。4.1软件设置分析，并对结果进行后处理。

n)使用均方根(RMS)算法激活光谱归一化。

o)从平均光谱窗口中选择所需的m/z，显示单离子图像。

p)通过选择感兴趣的离子来显示多个单个离子。

参考

1. Bhattacharya, s.k.(2017)。Lipidomics。分子生物学杂志，2009。