提出了对拟南芥、水稻和番茄等常见模式植物叶片测量的优化方案。由于植物产生的代谢物具有很大的化学多样性和动态范围，这些代谢物的提取受到生长条件的强烈影响，并且在不同的组织和器官类型之间可能存在显著差异。因此，获得代表性样品所需的萃取缓冲液的体积可能根据所分析的特定植物物种和组织类型而变化。因此，优化萃取缓冲体积以确保得到的样品能够代表所研究的植物材料是很重要的。
1植物栽培和取样
(a)在最佳生长条件下培育你感兴趣的植物。
(b)用干净的剪刀或剃刀收割植物叶片。
(c)将收集的植物材料放入2.0 mL圆底微离心管中。
(d)将氧化锆球或金属球放入每个样管中，盖好盖子，立即在液氮中冷冻。
(e)将冷冻的植物组织用搅拌机在25赫兹下研磨2分钟。
(f)将冷冻的地面样品保存在-80℃，以备后续使用。
2 aliquotation样例
(a)将所有样品置于液氮中保存;确保液氮不进入样品管。
(b)将新的2.0 mL圆形底形微离心机管浸入液氮中5 s，置于分析天平稳定位置，快速打开“自动归零”开关。
(c)等分并尽快将冷冻粉末(如50mg±5mg)转移到样品管中，以防止样品解冻。
(d)检查每个样管的样品重量。
(e)关闭样管盖，将样品放回液氮中。
(f)写下样品的重量。
(g)将所有样品等份保存在-80℃，直到提取。
3植物代谢物的提取
(a)打开装有冷冻地面样品的样管的盖子。
(b)将预冷的氧化锆珠放入样管中。
(c)每1mg冻土样品加入5 μL萃取液(例如，51.2 mg冻土样品加入256 μL萃取液)。
(d)关闭样管盖，将样品放回液氮中。
(e)用混合机在25赫兹下使样品均质4分钟。
(f)将样管在4℃下20000 × g离心10min。
(g)将上清液转移到新的1.5 mL圆形底形微离心管中。
(h)将新样管在4℃下20000 × g离心5min。
(i)将上清液转移到新的1.5 mL圆形底形微离心管中。
(j)提取液4℃保存，待LC-MS分析。
LC-MS分析
(a)建立带自动进样器的LC-MS系统，用于植物次生代谢物分析。
(b)设置两种洗脱缓冲液的HPLC瓶。
(c)将样品提取液转移到适合LC-MS分析的玻璃瓶中，并将其放入自动进样器托盘中。
(d)在萃取缓冲液空白测量后分析样品，以平衡LC-MS系统。
5数据分析
(a)使用MS制造商提供的软件(如Thermofisher的Xcalibur、SCIEX的Analyst、Agilent的MassHunter)或免费软件(如MSFact、XCMS2、BINBASE、MZmine2和TagFinder)分析获得的数据。
(b)考虑峰形和峰移，按峰面积或峰高评价数据。
(c)导出所有检测到的峰值的信号强度数据，形成一个完整的数据矩阵。
(d)利用IS的样本权值和峰值强度对整个数据进行归一化。
6峰值预测、标注和识别
由于植物次生代谢物结构复杂，其鉴定和注释尤其具有挑战性。当试图识别一个峰时，有两种常用的最佳实践:要么从植物提取物中纯化目标峰，并通过核磁共振研究鉴定，要么通过用真正的标准化合物共洗脱谱分析鉴定该峰。然而，在植物次生代谢物的代谢组学方法中，由于这些化合物结构的复杂性和多样性，真正的标准化合物的可用性受到限制。因此，植物代谢组学最大的挑战往往是“峰注释”。这包括使用各种结构信息来源(如MS/MS分析、参考提取物、突变分析和网络资源)提供峰的化学和结构规格。“峰值识别”提供了完整的特征描述，而“峰值注释”是在可用资源有限的情况下提供尽可能多信息的一种方式。
参考
- António, C.(编)。(2018)。植物代谢组学:方法和方案。胡玛纳出版社。