为了鉴定和定量大尺寸二维凝胶中的磷蛋白，制备不含碳水化合物和核酸等干扰化合物的高质量蛋白质样品是很重要的。苯酚-乙酸铵/甲醇法已成功地从大豆和油菜籽的发育种子(富含油脂和碳水化合物)中提取蛋白质，适用于生成高分辨率二维凝胶参考图。苯酚基萃取法也被许多其他实验室用于大规模的磷蛋白分析。基于这些和其他基于凝胶的蛋白质组学研究，可以说，苯酚-乙酸铵/甲醇方法提供了适合进行高分辨率2-DGE的高质量蛋白质，同时在蛋白质分离过程中最大限度地减少了蛋白质水解和阻断内源性磷酸酶活性。然而，我们不能排除内源性磷酸酶或蛋白酶活性非常低的可能性。考虑到这一点，添加磷酸酶和蛋白酶抑制剂总是好的。
然后用2-DGE分离分离蛋白。下游2-D凝胶图像分析和定量需要生物和实验复制。将2-DGE技术与改良的Pro-Q DPS方法相结合，实现了磷酸化蛋白的大规模检测和定量。
根据二维凝胶的图像分析和表达谱分析，切除的二维斑点用胰蛋白酶凝胶消化。然后将提取的肽进行质谱分析和数据库分析以鉴定磷酸化蛋白。我们试图在本章中提供一步一步的信息。然而，很难提供这一分析所涉及的所有步骤的细节。例如，使用ImageMaster 2D Platinum软件来描述二维凝胶图像分析的步骤几乎是不可能的。在这种情况下，鼓励读者使用ImageMaster软件的用户手册。我们应该强调的是，所有不同斑点的检测和这些斑点的手工编辑是二维凝胶图像分析的重要步骤。最近，ImageMaster软件已经更新，现在正在使用该软件的第6版。
总蛋白提取:苯酚-乙酸铵/甲醇法
a)将250mg植物材料用液氮在研钵和杵中研磨成粉末。
b)加入10 mL苯酚提取缓冲液，继续研磨30 s。
c)转移到15毫升的Falcon管中，在4°c的动轴上搅拌30分钟。
d) 2800 g(4°C)离心30分钟。
e)将上相溶液转移到新鲜的50ml Falcon管中。
f)加入5体积醋酸铵/甲醇溶液(冰冷)，涡旋，在- 20℃下孵育过夜，沉淀苯酚提取的蛋白质。
g) 2800 g(4°C)离心30分钟，收集沉淀。
h)用冰冷的醋酸铵/甲醇溶液洗涤2次，然后用冰冷的80%丙酮溶液洗涤2次，最后用冰冷的70%乙醇溶液洗涤。
i)在37°C下干燥最终颗粒(除去洗涤液后)20分钟。
j)将最终颗粒重悬在IEF萃取液中。
k) 28000 g RT离心15分钟。
l)小心地将清清上清液转移到新的1.5 ml微管中。保存在- 80°C的一次性等份中。
蛋白质定量:一种改进的Bradford法
a)用0.5× SDS流动缓冲液在1.5 ml的微管中稀释蛋白质样品，混合。
b)以0.5× SDS运行缓冲液为空白，在微量滴定板第一柱上加6 μL。
c)取1 mg/mL牛血清白蛋白标准品1、2、4、6 μL，分三份加入孔中，用0.5× SDS流动缓冲液使终体积达到6 μL。
d)在孔中加入稀释10倍的蛋白样品1 μL，一式三份，加0.5× SDS流动缓冲液5 μL，使总体积为6 μL。
e)在蛋白孔中加入200 μL稀释的Bradford染料。
f)混合，室温孵育5分钟。
g)在分光光度计上旋转微量滴度板，在595 nm处测量吸光度。
h)计算蛋白质浓度。
3总蛋白的等电聚焦
a)在1.5 ml的微管中加入1 mg蛋白，用IEF萃取缓冲液使终体积达到450 μL。
b)在同一管中加入2.25 μL(终浓度0.5%)正确的IPG缓冲液。
c)将样品在28000 g涡旋离心5分钟，除去不溶性物质。
d)将上清液从一端移到另一端的IPG聚焦盘中。
e)剥离脱水IPG条(pH 4-7);24cm)，用镊子将干燥的丙烯酰胺面朝下放入IPG聚焦托盘中的样品孔中。
f)将聚焦盘盖上盖子，放在塑料袋中，以减少蒸发。
g)让IPG条在室温下补水90分钟。
h)用矿物油(~ 2.5 mL)覆盖IPG条，防止脱水。
i)将IPG聚焦托盘放入Protean IEF细胞单元。
j)进行主动再水化(50v下10h)，按照三步聚焦方案:100v 100v h, 500v 500v h, 8000 V 99kv h。
组装Ettan dalt12凝胶施法者单元
a)将dalt12单元向后倾斜，使其靠在支撑腿上。
b)在后壁上放置较厚的分离片，以便聚合后轻松地从凝胶浇注装置中取出最后一个盒。
c)使用湿巾用去离子水和乙醇仔细清洁每个玻璃板。
d)用分隔片交替填充纸盒。用分隔纸结束，然后用较厚的分隔纸使堆叠的水平与连铸机的边缘均匀。
e)用少量凝胶润滑泡沫垫片，并将其放置在面板上的凹槽中。
f)将四颗黑旋钮螺钉插入底部的四个螺纹孔中，直至完全啮合。通常两到三个完整的转身就足够了。
g)将面板小心地放置在脚轮上，底部槽固定在各自的螺钉上。将剩下的四个黑旋钮螺钉旋入面板两侧的孔中，并均匀拧紧所有八个螺钉。组装好的单元现在可以浇注凝胶了。
5将12% SDS-PAGE浇铸到Ettan dalt12凝胶Cas中
a)在1 l侧瓶中加入300 mL丙烯酰胺原液，188 mL 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8, 7.5 mL 10% SDS, 252 mL去离子水，铸造12个凝胶。这是分离凝胶溶液。
b)将烧瓶放在搅拌板上，加入一个中等大小的搅拌棒，搅拌溶液。
c)将侧臂连接到真空上，用实心橡胶塞盖住顶部开口，真空30分钟。
d)关闭真空，拆卸橡胶塞，断开软管。
e)边搅拌边加入3.6 mL 10%过硫酸铵。
f)加入120 μL的TEMED，继续搅拌30 s。赶快去浇铸凝胶。
g)将凝胶溶液通过静液平衡室缓慢倒入脚轮，直至低于所需凝胶高度约2cm。
h)将置换液倒入腔内，直至置换液位于玻璃板表面以下0.25 cm处，然后立即将进料管放入密封圈内停止流动。
i)非常缓慢地用1.5 mL去离子水覆盖每个凝胶。
j)用保鲜膜覆盖机组上部，防止脱水。
k)允许聚合16h。
l)将本机放在水槽附近，仔细拆卸，并刮去通道丙烯酰胺。
m)向前拉隔膜片，将凝胶盒从脚轮上取下，用去离子水冲洗每个凝胶盒的外表面，去除任何聚丙烯酰胺颗粒，并将凝胶盒放置在盒式架上。
n)将10.6 mL丙烯酰胺原液、20 mL 0.5 M Tris-HCl、pH 6.8、0.8 mL 10% SDS和48.8 mL去离子水混合在200 mL烧杯中制备堆叠凝胶溶液。
o)在搅拌板上充分搅拌溶液。
p)搅拌溶液时加入0.6 mL 10%过硫酸铵。
q)加入40 μL的TEMED，继续搅拌30 s。
r)用塑料转移移液管在分离凝胶上放置足够的堆积凝胶溶液，使聚合后的高度达到2cm。
s)在每个凝胶上覆盖1ml异丁醇。
t)允许聚合约1小时。
u)一旦聚合，倒出异丁醇，用去离子水清洗几次，以去除任何异丁醇的痕迹。
v)在堆叠凝胶上加1倍SDS运行缓冲液，防止脱水。
6 IPG条带中蛋白质的还原/烷基化
a)用镊子握住IPG条的一端，将IPG条从IPG聚焦托盘中取出，并用kimw纸巾吸去多余的矿物油。
b)使用Protean IEF系统24cm一次性托盘将IPG试纸置于装有2.5 mL还原液的孔中，凝胶面朝上。
c)在RT下，在摇摆平台中速孵育15分钟。
d)将IPG试纸转移到一个新的一次性托盘中，每孔中加入2.5 mL烷基化溶液。
e)再次在摇台中速孵育15分钟。
f)将IPG试纸再次转移到一个新的一次性托盘中，每个孔中装有2.5 mL 1x SDS流动缓冲液，进行短暂洗涤。IPG试纸现在可以进行SDS-PAGE了。
7 sds - page
a)用镊子握住IPG条的一端，将IPG条从托盘中取出，小心地放在堆叠凝胶表面。
b)将含有1-2 μL PeppermintStick磷酸蛋白标准品的电极灯芯(0.5× 0.5 cm2)放置在测试条的酸性端旁边。
c)用2-3 mL琼脂糖覆盖液快速覆盖IPG条和电极芯。
d)向分离装置的下腔中倒入约7.5 L的1× SDS运行缓冲液。
e)琼脂糖凝固后，将凝胶盒通过两侧有橡胶垫圈的缓冲密封槽插入分离装置。
f)倒入2.0 L左右的2× SDS运行缓冲液，直至溶液达到分离装置上标记的高度。
g)以2w /gel的速度运行电泳装置，直到染料从凝胶上迁移。
8 Pro-Q DPS检测及图像采集
a)从分离装置中逐一取出胶盒，打开胶盒，小心地将凝胶转移到一个大的凝胶染色托盘中。
b)用去离子水清洗凝胶两次，每次10分钟。除非另有说明，否则在RT下以35rpm的速度在轨道激振器上持续振荡，在此改进的Pro-Q DPS程序的所有步骤中孵育。
c)倒入去离子水，将凝胶浸入200 mL固定液中。倒入固定液并重复。
d)将凝胶浸入250 mL洗涤液中15分钟，倒入洗涤液并重复。
e)凝胶在150ml染色液中黑暗孵育2小时，然后滗出溶液。
f)将凝胶浸入250 mL脱色液中，在暗处孵育30分钟。倒入脱色液，重复此步骤三次。总需要滞留时间为2小时。
g)用250毫升去离子水在黑暗中洗涤5分钟，倒入去离子水，重复。
h)使用532 nm激发和580 nm带通发射滤光片(富士胶片FLA 5000)的激光成像仪扫描凝胶。以100 μm分辨率，16位TIFF文件的形式收集和分析数据。
i)使用图像测量分析软件和ImageMaster 2D白金软件版本5或6来显示和分析数据。
9胶体CBB总蛋白检测
a)凝胶成像完成后，将凝胶浸入250 mL胶体CBB中搅拌16 h，检测总蛋白，然后在去离子水中染色。
b)分别使用ScanMaker 9800XL (300 dpi分辨率，16位灰度像素深度)和ImageMaster软件对凝胶进行扫描和分析。
c)滗析染色液，加入250 mL凝胶储存液，将凝胶在4°c下保存数月。
10磷蛋白和蛋白斑点切除和凝胶内消化
a)使用Adobe photoshop通过对齐磷蛋白和蛋白质标记，将磷蛋白和蛋白质的图像覆盖为假色。
b)在0.15 mm斑点拾取器的帮助下，以蛋白质斑点为标志，手动去除所需的磷酸化蛋白斑点，并转移到96孔MultiScreen板上。
c)使用真空歧管系统处理凝胶内消化反应。
d)用200 μL凝胶洗涤液在微孔板摇床上以50转/分的转速轻轻搅拌15分钟，在RT下染色凝胶塞。使用真空歧管系统将溶液从滤板底部排出。重复此步骤两次以上或直到所有污渍被清除。
e)用100 μL乙腈将凝胶塞脱水5min，真空抽除乙腈。
f)用湿巾轻轻吸干平板，去除残留的乙腈。
g)将96孔v底样品采集板置于MultiScreen板下方。
h)在孔中加入50 μL胰酶凝胶溶液，使凝胶塞水化，在板上盖上胶膜，将卡带放入塑料密封袋中。
i) 37℃孵育16小时。
j)在孔中加入100 μL凝胶内萃取液，室温温和搅拌孵育10 min。
k) 2000 × g离心2min，将胰蛋白酶消化肽收集到v底聚丙烯收集板中。
l)再次重复步骤10和11。
m)使用centrvap Console干燥池中提取的肽，并在- 80°C保存。
11质谱分析和数据分析
a)将干燥后的颗粒用50 μL 0.1%甲酸重悬。
b)在LTQ ProteomeX线性离子阱LC-MS/MS仪器上加载15 μL，按照标准程序进行质谱分析。
c)使用SEQUEST算法作为BioWorks 3.2软件套件的一部分，在合适的数据库中搜索MS/MS数据。
d)为数据库指定搜索参数，然后指定蛋白质分配标准以识别磷酸化蛋白。
你可能感兴趣的是:
参考
- de Graauw, M.(2009)。Phospho-Proteomics。胡玛纳出版社。