蛋白质组学研究中蛋白质的提取和溶解方法在线调查

1.样品一代

1.1裂解/提取/再水化溶液

1.1.1用于哺乳动物组织和细胞的通用增溶鸡尾酒

典型的裂解溶液(17)包括:

5 M尿素。
2m硫脲。
0.25% (v/v) CHAPS (Sigma)。
0.25% (v/v)吐温-20 (Bio-Rad)。
0.25% (v/v)磺基甜菜碱(SB) 3-10 (Sigma)。
0.25% (w/v)载体两性电解质(1:1:1:1:1 Bio-Lyte 3-10 [Bio-Rad]、Servalyte 3-10 [Serva]、Ampholine 3.5-9.5 [Amersham Biosciences]和Resolyte 4-8 [BDH]的混合物)。
2mm三丁基膦(TBP)。
10%异丙醇。
12.5% (v/v)水饱和异丁醇。
5% (v/v)甘油(Bio-Rad)。
1mm钒酸钠(磷酸酶抑制剂，Sigma)。
1X完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒(勃林格-曼海姆)。

这种裂解液可以在-80°C下密封保存数周。必须注意酒精在长时间内可能蒸发的问题。对于给定的应用，可能需要改变洗涤剂的混合物和水平。在某些情况下，0.25-0.5%的Triton X-100比Tween-20产生更好的结果，或者增加CHAPS水平可以溶解更多的蛋白质。如果不能使用TBP，可以使用100 mM的二硫苏糖醇或5%的2-巯基乙醇，但效果不佳。如果将大量样品应用于凝胶条，两性电解质水平也可能需要增加。一般来说，最好保持洗涤剂(0.75-2%)和两性电解质(0.25-1.5%)水平尽可能低，以获得最佳分辨率。

1.1.2植物种子一般增溶鸡尾酒

典型的植物萃取/增溶溶液包括:

6m尿素。
2m硫脲。
0.5% (v/v) CHAPS (Sigma)。
0.25% (v/v) Triton X-100 (Bio-Rad)。
0.25% (v/v) SB 3-10 (Sigma)。
0.35% (w/v)载体两性电解质(1:1:1:1:1 Bio-Lyte 3-10 [Bio-Rad]， Servalyte 3-10 [Serva]， Ampholine 3.5-9.5 [Amersham Biosciences]和Resolyte 4-8 [BDH]的混合物)。
2mm三丁基膦(TBP)。
16%异丙醇。
5% (v/v)甘油(Bio-Rad)。
1X完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒(勃林格-曼海姆)。

这种裂解液可以在-80°C下密封保存数周。如上所述，必须注意酒精在长时间内可能蒸发的问题。如上所述，这种混合物可能需要根据具体的植物组织类型进行经验修改。

1.2细胞裂解物

如U937人单核细胞系的细胞通常直接溶解在溶解/再水合溶液中，浓度约为20,000个细胞/μL或约1.5 mg蛋白质/mL。更小的细胞(如单核细胞和脾细胞)在约80,000个细胞/μL的浓度下溶解，约为1.28 mg蛋白质/mL)。在室温下在Nutator混合器上提取30分钟后，样品在15300 g的微离心机中离心5分钟澄清。酒精的存在似乎使核酸从溶液中沉淀出来，而混乱剂-洗涤剂混合物溶解并释放RNA和dna结合蛋白。

1.3.血清

大鼠血清(通常约为55 mg蛋白/mL，但范围约为40-100 mg蛋白/mL)要么直接稀释到裂解/再水化溶液中进行分析，要么首先用亲和柱去除白蛋白、igg等。然后将耗尽的血清样品浓缩回初始蛋白水平，并稀释成裂解/再水合溶液。

1.4.组织

组织在液氮中冷冻，并用生物粉碎机在液氮中粉碎(大小可容纳10毫克至10克组织)。在室温下，以约2-3 mg组织/mL裂解/再水化溶液的水平提取粉碎的组织30分钟。提取液通过离心澄清，上清液要么立即分析，要么保存在-80°C。新鲜骨样品可以用类似的方法使用微低温粉碎机粉碎和处理。

1.5.尿液

用膜过滤装置(Centricon 3, Amicon)浓缩尿液(通常在24小时内少于1.5 mg蛋白质/mL)，或在稀释前将其冻干，最终浓度约为1-2 mg蛋白质/mL。

2.集中参数

因为蛋白质的溶解度也取决于盐的数量(以及焦耳加热时产生的水分损失)，所以在每次电泳开始时，等电聚焦步骤会慢慢增加。再水化固定化pH梯度(IPG)条带通常使用以下方案集中在Bio-Rad Protean IEF单元中。一般情况下，总伏时数应为50,000 - 75,000。较窄范围的pH梯度比宽范围的pH梯度需要更长的聚焦时间。

1.pH 3.0-10，线性或非线性，18厘米长的IPG凝胶条，“正常样品。”150-V快速坡道1小时;250v快速斜坡1小时;400-V快速坡道4小时;1万v线性斜坡持续14小时;10,000 v快速斜坡作为额外伏特小时的保持步骤。典型的聚焦总伏特小时为60000 - 75000。

2.pH 3.0-10，线性或非线性，18厘米长的IPG凝胶条，样品含盐高达150毫米。50伏快速斜坡4小时;150-V快速坡道1小时;250v快速斜坡1小时;400-V快速斜坡4小时;1万v线性斜坡持续12小时;10,000 v快速斜坡作为额外伏特小时的保持步骤。典型的聚焦总伏特小时为60000 - 75000。

3.pH 3.0-10，线性或非线性，11厘米长的IPG凝胶条“正常样品。”150-V快速坡道1小时;250v快速斜坡1小时;400-V快速坡道4小时;8000 - v线性斜坡持续14小时;8000 - v快速斜坡作为额外伏特小时的保持步骤。典型的聚焦总伏特小时为55,000-60,000。

4.pH 3.0-10，线性或非线性，11厘米长的IPG凝胶条，样品含盐高达150毫米。50伏快速斜坡4小时;150-V快速坡道1小时;250v快速斜坡1小时;400-V快速斜坡4小时;5000 - v线性斜坡持续14小时;5000 - v快速斜坡作为额外伏特小时的保持步骤。典型的聚焦总伏特小时为55,000-60,000。