1利用金属亲和层析吸管头富集MALDI-TOF和纳米电喷雾质谱前的磷酸肽
1.1 ZipTipMC的充电与平衡
a)准备1ml金属离子溶液。
b)用10 μL 0.1%新鲜醋酸加50%乙腈洗涤针尖，配以废弃物三次。
c)以10 μ l等分金属离子溶液进行10次抽放循环，向尖端充入该溶液的多个柱体积，使金属离子进入柱内。
d)用10 μL高纯水洗净针尖，配三次废液。用10 μL新鲜1.0%乙酸，10%乙腈洗净针尖，配以废弃物三次。
e)用10 μL合适的结合液清洗、配药至浪费5次，使针尖平衡。
f)使用后，可清洗和再生，最多可重复使用三次。
1.2用MES缓冲液(pH 5.5)结合洗涤
a)在酸性结合溶液中稀释样品，如MES、甲酸或乙腈水溶液中的乙酸。
b)用1- 10 μ l的体积将移液器柱塞完全压至完全停止，将样品与ZipTip结合。
c)抽吸和分配样品5至10个周期，以最大限度地结合。
d)将针尖洗净，用10 μL结合液分三次。
e)用10 μL 0.1%醋酸加50%乙腈洗涤针尖，分装废弃物三次。
f)用10 μL高纯水洗净针尖，并将其放入废液中三次。
1.3选择:使用0.1%醋酸或0.01%甲酸进行粘合和洗涤
a)在结合液(0.1%醋酸或0.01%甲酸)中稀释样品。
b)用1 ~ 10 μ l的体积将移液器柱塞完全压至完全停止，将样品与ZipTip结合。
c)抽吸和分配样品5至10个周期，以最大限度地结合。
d)将针尖清洗干净，用粘接液涂抹三次。
e)用10 mL 0.1%乙酸(或0.01%甲酸)、50%乙腈清洗针尖，分三次。
f)用高纯净水将针尖清洗三次，放入废液中。
1.4 MALDI-TOF质谱法磷酸肽的洗脱
a)用标准吸管头将2 μL新配制的氢氧化铵洗脱液移入干净的小瓶中。
b)在不引入空气的情况下，通过ZipTip抽吸和分配洗脱液4至6次。
c)为了直接点染到MALDI-TOF MS靶板上，将所需体积的洗脱磷酸肽溶液抽吸到ZipTip中，直接分配到靶板上，部分干燥，然后用1 μL基质覆盖。
1.5纳米电喷雾质谱法磷酸肽的洗脱(见注6)
a)执行副标题1.4中的步骤1和步骤2。
b)为了将样品直接装入纳米电喷雾质谱针，将样品洗脱到干净的埃彭endorf管或小瓶中，或使用geeloader尖端直接导入纳米电喷雾针中。
c)在GELoader尖端与毛细管(即窄端)融合处上方约2-3毫米处切割。
d)在最终分配样品之前，将剪下的GELoader针尖牢牢地压在ZipTip移液器针尖上，轻轻扭动。无泄漏配合允许洗脱直接进入纳米喷雾针。
2磷酸丝氨酸修饰为s -乙基半胱氨酸
a)在通风柜中，将肽溶解在装有50 μL孵育混合物的有盖管中。
b)用氮气冲洗试管，在50℃下孵育1小时。
c)待冷却后，加入10 μL冰醋酸。
d)直接使用衍生化肽进行分析或先进行真空离心浓缩。
e)相邻脯氨酸残基的磷酸丝氨酸衍生化过程中β-消除步骤缓慢;因此，在50℃下，反应时间可延长至18 h。乙腈可以代替常规溶剂，以减少后续操作。
f)本程序也可用于选择性分离磷酸丝氨酸肽。当将s -乙基半胱氨酸肽应用于反相高效液相色谱柱(如Vydac C18)并用0.1%三氟乙酸(TFA)的水/乙腈线性梯度洗脱时，衍生化肽比天然磷酸肽平均晚4 - 5%乙腈出现。来自双重磷酸化物种的衍生化肽将比单一衍生化物种相应更晚洗脱，表明该方法适用于多磷酸丝氨酸肽。通过这种“对角线”技术衍生化前后的高效液相色谱法即使从非常复杂的混合物中也能产生高度纯化的肽，因为所有其他的洗脱位置将不受影响。
3质谱法选择性检测磷酸肽
a) 63 Da (PO2)磷酸特异性片段离子-)和79da (PO3)-这种通过碰撞诱导形成的低质量片段离子作为目标修饰的特征和选择性标记来选择性检测翻译后修饰的技术，已被扩展到识别其他修饰，如糖基化、磺化和酰化。
b)质谱阶梯测序涉及生成一组嵌套的多肽链片段，然后分析每个成分的质量。粗糙多肽混合物中的每一组分与下一组分不同，其质量损失是残基重量的特征(可能涉及修饰的侧链)。通过这种方式，可以从质谱中获得的质团中读取多肽的序列。
4碱性磷酸酶去磷酸化后磷酸肽的检测
a)对每个经IMAC或HPLC富集过磷酸肽的样品的等分液进行MALDI-TOF质谱分析。
b)将分离的样品溶解在0.5 μL的50mM NH4HCO3溶液中，pH 8.9，其中含有0.05或1单位小牛肠道碱性磷酸酶/μL。
c) 37℃孵育2小时。
d)对于MALDI- tof，多肽可以在C18 ZipTips上脱盐，用80% (v/v)水溶液乙腈，0.1% TFA，含有MALDI基质α-氰基-4-羟基cinnamic酸(Aldrich)直接洗脱到靶板上。
e)去除磷酸盐引起的80 Da的质量位移可以明确地确定特定肽是否被磷酸化。
4.1.靶向碱性磷酸酶治疗
a)对副标题3.4中富含磷酸肽的样品进行MALDI-TOF质量分析。采用α-氰基-4-羟基肉桂酸基质。
b)用含有0.05 U/μL碱性磷酸酶的50 mM碳酸氢铵1-1.5 μL在靶上溶解样品/基质混合物。
c)将相同的样品与碱性磷酸酶在MALDI靶上原位孵育1-2小时，温度为37°c，在封闭的高湿室中(理想的是带盖子的塑料盒，箱内装有湿纸巾)，以防止干燥。
d)加入0.5 μL乙腈/TFA溶液停止去磷酸化反应，立即在真空中干燥样品，使基质适当结晶。
e)像之前一样重复MALDI-TOF质谱，以确定哪些肽的质量改变了80 Da(或其倍数)。
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参考
- J. M.沃克(主编)。(2005)。蛋白质组学协议手册。胡玛纳出版社。