2-D PAGE细菌样品制备方法在线调查

1一般增溶方案

至关重要的是，所有的细菌都被破坏，这样裂解缓冲液就能接触到所有的蛋白质。在用不同的化学试剂依次进行多次提取的研究中，如果越来越多的细菌在过程中被破坏，它将掩盖结果。破坏的最佳方法取决于细菌的类型。

在大多数情况下，通过超声波破坏就可以了，但可能需要添加溶酶体来破坏细胞壁。在SDS或含有硫脲的裂解缓冲液中进行裂解是有利的，在这些缓冲液中大多数蛋白酶都是变性的。如果必须进行长时间的操作，例如通过不同的离心步骤进行分离，则应添加蛋白酶抑制剂(见注9)。在下面的程序中，将细菌在2% SDS, 65 mM DTE中超声处理，并煮沸，以增强蛋白质的溶解性。有人认为，用于预增溶的SDS不会干扰一维电泳分离，因为它与裂解缓冲液的非离子洗涤剂形成胶束并迁移出条带。尽管如此，与裂解缓冲液中洗涤剂的量相比，SDS的量应保持较低。

下面的程序描述了从颗粒状细菌中溶解蛋白质的过程。如果在纯化步骤中沉淀了蛋白质，则应直接添加裂解缓冲液(步骤H)，用量尽可能高。

A.从适量的细菌颗粒开始。
B.加入4倍体积的2% SDS, 65 mM DTE。
C.根据样品大小，进行三次2-20秒的超声波检测。
D.短暂旋转以收集样本。
E.重新悬浮任何可能形成的颗粒。
F.煮5分钟。
G.让样品冷却。
H.在1 vol萃取液中加入8 vol裂解缓冲液
1 .声波三次，每次5秒，间隔时间冷却。
J.将样品放在摇台上30分钟。
K.在20,000g下旋转15分钟，收集上清。
L.评估蛋白质浓度。
M.立即运行第一个尺寸或将样品在-70°C下保存数月。

2样品纯化

常见的污染物在2-D PAGE研究是盐，小离子化合物，多糖，核酸和脂质。如果观察到不良的一维聚焦，盐是最可能的原因。由于盐的高浓度，提高了带材的导电性和水分迁移，将导致水平条纹。采用条状复水化加载样品时，盐浓度应低于10mm。小的带电物质也可能干扰等电聚焦。多糖可能堵塞凝胶，并可能通过静电相互作用使蛋白质复合。脂质也可能堵塞凝胶，但主要是由于疏水蛋白的络合和洗涤剂的结合造成的问题。核酸可能堵塞凝胶，通过静电相互作用结合蛋白质，并造成条纹，特别是在银染色中。

透析和沉淀是将盐和小离子化合物的浓度降低到可接受水平的直接而有效的方法。透析造成最小的样品损失，但需要相对大量的溶质，而且相当耗时。例如，使用Millipore的Amicon Ultra进行自旋透析，速度更快，不需要额外的溶质体积，但蛋白质可能会因吸附在透析膜上而丢失。沉淀法也可用于去除多糖和一定程度上的脂质。大量的多糖可以用超离心法去除。如果脂质引起了主要问题，必须针对特定样品优化洗涤剂的数量和性质。大量的核酸可能需要DNase/RNase处理。

在样品纯化过程中，蛋白酶的存在可能是一个问题，在这种情况下，必须添加蛋白酶抑制剂。必须强调的是，在加入裂解缓冲液之前的样品纯化应该只在必要时进行，而不是作为样品制备的标准部分。

2.1降水

沉淀对于去除大多数污染物(包括盐)是非常有效的，但沉淀剂不会沉淀所有的蛋白质，并且一些蛋白质在沉淀后很难再悬浮。当需要总蛋白质含量的图片时，这尤其是个问题。

TCA和丙酮的组合是2d PAGE研究中最常见的沉淀剂，因为它比单独使用这些试剂中的任何一种都更有效。此外，在10%的TCA中，很少有蛋白酶具有活性。单独用丙酮(75%终浓度)沉淀后，溶解更容易，但沉淀不完全。

A.在冰丙酮中加入10%的TCA和20mm的DTE。
B.在-20°C下放置2小时。
C. 10000g离心10min。
D.用含有20mm DTE的冷丙酮清洗。
E.重复清洗。
F.让颗粒干燥以去除残留的丙酮。
G.在裂解缓冲液中重悬颗粒。

2.2 DNase/RNase处理

如果核酸含量高，样品会出现粘稠，银染色后会出现涂片。如果超离心不能解决问题，酶消化可以。

a .加入1/10样品体积的溶液，其中含有1mg /mL DNase I, 0.25 mg/mL RNase a和50mm MgCl2。
B.冰上孵育20分钟。

参考

1. J. M.沃克(主编)。(2005)。蛋白质组学协议手册。胡玛纳出版社。