1.哺乳动物组织和细胞中蛋白质提取物的制备
从许多动物组织中制备蛋白质提取物相对简单，因为细胞膜较弱，容易被渗透力和机械力破坏。
通常萃取的第一步是洗涤，然后用均质机在适当的缓冲液中均质，然后用离心澄清。离心分离法从膜组分和不溶性细胞碎片中分离出可溶性蛋白质。各种细胞悬浮液可以通过机械方法或酶消化从组织或器官中制备。一般来说，酶消化是可取的，因为它对细胞完整性的破坏较小。或者，乙炔二胺四乙酸(EDTA)通常可以加入螯合Ca2+离子，钙离子通常参与细胞-细胞粘附。
2.从培养细胞中提取蛋白质
从细胞裂解产物中提取蛋白质是蛋白质组学分析的先决条件。蛋白质的提取可以通过一步提取或分布提取进行。一步提取法需要完全溶解细胞蛋白(尤其是疏水蛋白)，这可能会影响蛋白质组学分析的全面性和准确性。分步提取法不仅提高了疏水蛋白的提取率，而且提高了双向凝胶电泳分离时的分辨率。
2.1细胞培养和收集
细胞在特定培养基中培养[例如COS7细胞系在含有10%血清的Dulbecco's Modified Engly Media (DMEM)培养基中培养]。细胞培养至对数生长期后，用0.25%胰蛋白酶消化后离心。在培养基中重悬。计数并分成两份，离心，丢弃培养基，用低盐磷酸盐缓冲液洗涤3次。
2.2逐步提取
分步萃取是用三种分别适用于高、中、低亲水性蛋白的溶解溶液进行三步萃取。
步骤1:水溶液裂解萃取。将约5 ~ 15ng(湿重)的细胞加入到2 ml的裂解液中[40 mmol/L Tris -aminomethane (Tris - base) pH 8.3 ~ 8.4]。反复冻融3~4个循环。加入20ug/ml牛胰腺脱氧核糖核酸酶(DNase I)和5ug/ml核糖核酸酶A (RNase A)在4℃下搅拌15 min，摇匀5 min, 10℃下12000r/min离心10 min，收集上清，冷冻干燥。剩余沉淀物用40 mmol/L三羟甲基氨基甲烷溶液洗涤2次。
步骤2:提取含有尿素等不同成分的裂解液。在epppendrof微离心管中加入500 ul裂解液II (8 mol/L尿素，4% 3-(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]丙磺酸(CHAPS)， 100 mmol/L二硫代乙醇(DTT)， 40 mmol/L Tris-碱和0.5% ph3 ~ 10的药物，20ug/ml DNase I和5ug/ml RNase A)，搅拌5 min, 10℃，14000 r/min，离心60 min。收集上清液。剩余沉淀物用40 mmol/L Tris碱溶液洗涤2次。
步骤3:用含有硫脲-辛烷基硫甘氨酸三亚甲基盐-三丁基磷的裂解液提取。在Eppendrof微型离心机管包含上一步的沉淀,200 ul的溶解产物III (5 mol / L尿素,2摩尔/ L硫脲,2%的家伙,2% caprylyl sulfobetain (SB3-10), 2更易与L三丁基膦(真沸点),40更易与L Tris-base ph值和0.5%磷化氢(真沸点),40更易与L pharmaltes Tris-base和0.5%,ph值3 ~ 10,20 ug /毫升DNase我和5 ug /毫升核糖核酸酶A)。与强震混合后5分钟,离心机在10°C 10分钟12000 r / min。上层清液收集。
3.亚细胞提取物的制备
没有单一的好方法来分级分离所有组织。不能设想用于一种组织的分级分离可以应用于其他组织。亚细胞梯度分离的过程主要有两个步骤:组织和细胞的均质化和细胞器的分离。
任何均质化的基本目标都是最大限度地破坏细胞。破坏力用于对感兴趣的细胞器造成最小的损害(例如蛋白质变性和酶降解)，以及保持感兴趣的细胞器的原始结构和功能完整性。
破坏细胞的基本方法有:超声振动、机械研磨或剪切和氮空化。基于亚细胞组分的物理性质的方法被应用于分离。
参考
- J. M.沃克(主编)。(2005)。蛋白质组学协议手册。胡玛纳出版社。