1新鲜纸巾
a)新鲜组织应去除结缔组织和脂肪。最好，250mg的组织在切除前灌注冰冷的生理盐水，或至少在切除后短暂冲洗，并在室温下置于50ml烧杯中(RT)。快速加入8体积溶解缓冲液(RT)到组织中，用手术剪刀彻底切碎。冷却尿素基裂解缓冲液会导致尿素结晶，不建议使用。
b)然后将切碎的组织样品浆料放入3或5毫升的DUALL磨砂玻璃组织研磨机中并手动均质。手工均质的持续时间和程度取决于样品的结缔组织含量，并应继续进行，直到形成均匀的均质，没有组织碎片可见。应避免电机驱动的均质，因为在磨砂玻璃中快速旋转杵将导致显著的样品加热和蛋白质氨基化。
c)将得到的12.5%匀浆在室温下保持120分钟，然后将样品置于Beckman聚异体离心管(1/2 × 2 in)中，使用Beckman TL-100超离心机在22°c下，10万g离心30分钟，以去除核酸和不溶性物质。
d)澄清后的上清应分装成小体积，-45°C或-80°C保存。尽管组织蛋白含量(mg/g湿重)在哺乳动物组织类型之间可能有很大差异，但所得的蛋白质浓度应约为15- 20mg /mL。由于实验条件(例如，水肿，脱水等)引起的组织液异常可以改变这一估计，因此需要测量溶解样品中的蛋白质浓度。这可以用许多市售的尿素/洗涤剂兼容蛋白测定方法，如Bradford方法(Pierce)， RC DC蛋白测定(BioRad)和noninterference protein Assay™(Genotech)来完成。请记住，它们的线性检测范围非常窄。
2培养细胞
a)首先通过吸出将培养基从多孔板中取出。每孔直接加入400 μL裂解缓冲液A或B(见注释2和3)。
b)然后将培养板置于37°C培养箱中1小时，间歇(每15分钟)手动搅拌。
c)溶解1小时后，从每个孔中取出整个体积，置于2ml埃彭多夫管中。
d)然后在仪器设置#3下，使用Fisher Sonic Dismembranator对每个样品进行3 × 2-s脉冲超声处理。超声每15分钟进行一次，持续1小时。避免用超声探头接触管的两侧，因为这会产生气泡/泡沫和潜在的样品损失。
e)此时，可以对样品进行超离心(如上所述)，然后将溶解后的样品转移到微离心管中，在-45°C或-80°C保存，直到解冻用于分析。
你可能感兴趣的是:
参考
- J. M.沃克(主编)。(2005)。蛋白质组学协议手册。胡玛纳出版社。