二维PAGE酵母样品的制备方法在线调查

用于2D PAGE的酵母样品可以在(1)初始细胞破坏步骤中制备;(2)蛋白质溶解步骤;(3)核酸酶处理步骤;(4)最后阶段，在应用于2D PAGE的第一维之前，将蛋白质提取物在IPG补液缓冲液中稀释。

该过程在1.5 ml微离心管中进行。合适的起始材料是从10ml培养基中提取酵母细胞小球，密度为5-10百万细胞/mL，对应于光密度(610 nm)约为0.5，通常会产生5-10 μL细胞的小球。将下面描述的方法调整为此数量的单元格。

协议可以扩大或缩小;但是，应注意不要使用超过500 μL或小于50 μL的最终萃取量，因为这将降低细胞破坏步骤的效率。

1.细胞的破坏

A.向细胞颗粒中加入160 μL含有蛋白酶抑制剂的冰水。
B.在样品中加入0.25 g冷却后的玻璃珠(直径0.5 mm)。
C.在台式振动筛上以最高转速(约2500转/分)涡流4 × 30秒，间歇将样品放置在冰上至少1分钟。

2.蛋白溶解

A.加入20 μL的样品缓冲液I，使试管短暂旋转混合。
B.将试管置于95°C下5分钟。确保将试管盖固定，或将试管置于
C.在加热步骤之前，在盖子上打一个小洞。
D.在冰上冷却样品5分钟。

3.核酸酶治疗

A.加入20 μL的样品缓冲液II，使试管短暂旋转混合。
B.冰上孵育10分钟。
C.在4°C的微离心机中全速(约15,000g)离心样品。
D.将上清液(构成蛋白提取物)吸清至新的微离心管中，在-20°C冷冻，或立即使用。

4.ipg -补液缓冲液稀释

A.将样品溶解在所需体积的ipg -再水化缓冲液中。
B.将样品在37℃下孵育10分钟。
C.旋转样品(15000 g，室温，10分钟)，去除任何可能残留的颗粒。

参考

1. J. M.沃克(主编)。(2005)。蛋白质组学协议手册。胡玛纳出版社。