使用二氧化钛微柱从蛋白水解消化物中选择性分离磷酸肽的方案在线调查

TiO的原理₂本章描述的方法使用源自12种标准蛋白(模型蛋白)的胰蛋白酶消化的肽混合物来说明。TiO的₂净化法是一种简单直接的方法。它是快速和有效的磷酸肽富集，甚至从高度复杂的样品。

1模型蛋白和多肽混合物

a)每个蛋白溶解于50 mM碳酸氢铵，pH 7.8, 10 mM DTT中，37℃孵育1 h，还原后加入20 mM碘乙酰胺，室温孵育1 h，避光。孵育后，用10mm DTT淬灭每个反应。

b)用胰蛋白酶(1-2% w/w)在37℃下消化12 h。

2包装TiO₂Micro-Column

a)当处理不太复杂的样品时，使用TiO₂~3 mm微柱(~0.4 μg TiO)₂珠)。对于更复杂的样本，使用更长的列。TiO的容量₂对磷酸化肽是非常高的，所以即使是一个小柱将保留显著量的磷酸化肽。

b)悬浮~ 2mg TiO₂在500 μL 100%乙腈中。

c)戳掉一个小插头₈材料从3 M Empore™C₈使用高效液相色谱注射器针头提取磁盘，并将该插头放置在GELoader尖端的收缩端，例如使用LC毛细管。C₈材料会阻止TiO₂珠子不漏，同时仍允许液体通过。

d)用100%乙腈清洗膜，以降低膜塞中的聚合物水平:将20 μL 100%乙腈装入GELoader针尖，并用塑料注射器施加温和的气压。

e)准备TiO₂微柱填料TiO₂C上面的珠子₈膜盘在GELoader的尖端。加载TiO的一个等同项₂将悬浮液(取决于样品的量)放入GELoader尖端，并像上一步一样施加温和的空气压力。

3将样品加载到TiO上₂Micro-Column

a)用于装载或洗涤TiO的缓冲器是很重要的₂微柱中含有50-80%的乙腈，以消除多肽对C的吸附₈膜和TiO₂珠由于疏水相互作用。

b)将肽样品在TiO中稀释至少5倍₂加载缓冲液(v/v)并混合均匀。将样品加载到TiO上₂微柱通过施加空气压力。

c)清洗TiO₂用5 μL TiO测定微柱₂加载缓冲液，随后加入30 μL TiO₂洗缓冲区。

4从TiO中洗脱磷酸化肽₂Micro-column

a)洗脱与TiO结合的磷酸肽₂用至少25 μL的TiO测定微柱₂洗脱缓冲液1(取决于色谱柱的大小)。

b)由于多肽对C具有结合亲和力₈膜堵塞时，一些磷酸肽可能已经结合到C上₈在上一步(步骤1)中使用1 μl的TiO洗脱这些膜₂洗脱缓冲液2，将其与步骤1的洗脱液混合。

b)每10 μL洗脱液用1 μL 100%甲酸酸化池洗脱液。确保洗脱液的pH值为2-3。在这个阶段，纯化的磷酸肽可以用质谱分析。然而，建议先用反相色谱法对样品进行脱盐/浓缩。

装反相(RP)微柱用于脱盐/浓缩样品

a)根据物料的量，使用~ 3-6 mm (0.4-0.8 μg)的RP微柱。

b)将~2 mg POROS Oligo R3反相(RP)材料悬浮于200 μL 50%乙腈中。

c)从3m Empore™C18提取盘上冲压出C18材料的小塞，并将其放置在GELoader针尖的收缩端，制备RP微柱。

d)按照TiO的描述将RP珠装入GELoader针尖中₂子标题2中的珠子，步骤e。

e)将酸化后的样品缓慢加载到RP微柱上(~1滴/秒)。

f)用30 μL RP洗涤缓冲液清洗RP微柱。

6将样品装入反相(RP)微柱

a)将酸化后的样品缓慢加载到RP微柱上(~1滴/秒)。

b)用30 μL 0.1% TFA清洗RP微柱。

RP微柱上磷酸化肽的洗脱

a)用20 μL RP洗脱缓冲液将RP微柱上的磷酸肽洗脱，将磷酸肽冻干。注意:对于MALDI质谱分析，可以使用1 μL DHB溶液将肽直接从RP微柱洗脱到MALDI靶上。

b) LC-ESI-MSⁿ分析:将干燥后的磷酸肽溶解于0.5 μL 100%甲酸中，立即用UHQ水稀释至10 μL。

LC-ESI-MSⁿ在LC-ESI-MS/MS分析之前，通过超声将磷酸化肽重新溶解在含有EDTA的缓冲液中，可以改善多磷酸化肽的分析。

参考

1. de Graauw, M.(2009)。Phospho-Proteomics。胡玛纳出版社。