GST-Pull - down问答

答:由于DNA的存在，两个不相互作用的DNA结合蛋白可能会出现相互作用的假阳性结果。因此，在进行GST下拉试验时，添加核酸酶的步骤是必要的

答:(1)实验的第一步是gst标记的融合蛋白的融合表达，然后表达载体的选择是一个重要的因素。在选择载体时，我们要考虑载体表达的蛋白量、诱导物是否能诱导表达等因素。我们常用的向量是pGEX-4T-1。

(2)在进行蛋白诱导表达时，可溶性表达温度也是一个至关重要的因素。当温度过高时，矢量容易形成包涵体。如果络合不顺利，蛋白质失去活性，会影响后续实验。建议采用感应温度图，常用感应温度为16℃~25℃。

(3)诱导时间也很重要。添加诱导剂诱导表达的最佳时间为细菌对数生长期。诱导时间过长，诱导物就不会被细菌代谢掉，继续进行诱导蛋白表达的过程。诱导剂的浓度、诱导时间、孵育温度都是共同影响蛋白表达结果的因素。

A:可能有以下几个原因:(1)拔梳子时凝胶移动错误，渗入其他井或加入样品后漏出。因为内参表达高，所以不一定能显示出差异。

(2)添加样品时的不均匀会产生误差。

(3)凝胶制备应保证均匀无气泡，玻璃板清洁，以保证结果一致可靠。

A:如果样品中的蛋白质被蛋白酶降解，建议在操作过程中加入蛋白酶抑制剂。如果可能，整个操作应在4°C下进行，以减轻样品中的蛋白质降解。

A:不，这不会影响结果。一般所提供的纯化蛋白小样品纯度为>70%。有些蛋白质纯化过程中会有一些可能的插层蛋白、降解蛋白，这些蛋白不能被亲和层析去除。这不会影响后续的下拉结果分析。

答:不同物种对密码子的使用存在偏好，密码子优化有利于大肠杆菌真核蛋白的表达。

答:1)蛋白质序列有移位码等错误

测序确认，调整阅读框获得GST。标签融合表达蛋白。选择合适的寄主菌，如蛋白酶缺乏型大肠杆菌、稀有密码子寄主菌罗塞塔系列。

2)融合蛋白可能改变了GST的构象，从而降低了GST标记蛋白的结合能力。

所使用的pGEX载体中GST结合的检测。用所使用的pGEX制备细胞超声裂解液，并测定其与色谱柱的结合。如果结合良好，则可能是标记蛋白改变了GST的构象，降低了GST标记蛋白的亲和力。通过将结合温度降低到4°C来限制洗涤，可以改善结果。

3) GST融合蛋白发生聚集沉淀

将DTT加入裂解缓冲液和其他缓冲系统中。1-20 mM DTT显著增加了部分GST融合蛋白的结合。

4) GST融合蛋白过稀释

重新浓缩样品以增加蛋白质浓度。

5) GST融合蛋白通过机械裂解方法(如超声)变性

过度的超声发热会破坏标签蛋白，建议使用超高压破碎。

6)粘结缓冲条件不合适

pH低于6.5或pH高于8时，融合蛋白与色谱柱结合不足，结合效率低。确认磁珠在pH6.5~8.0缓冲液中完全平衡后，再用于目的蛋白的纯化。

7)色谱柱使用次数过多，杂质干扰

重新生成色谱柱或使用新的色谱柱。

答:1)洗脱缓冲液体积太小

增加洗脱缓冲液的体积。

2)洗脱缓冲液pH值过低

将洗脱缓冲液的pH值调整为8-9。

3)洗脱时间不够

增加洗脱缓冲液与磁珠反应的时间。

4)洗脱缓冲液中谷胱甘肽浓度过低

增加洗脱缓冲液中谷胱甘肽的浓度。

5)洗脱缓冲液中的谷胱甘肽未被氧化

洗脱缓冲液已经准备好并正在使用。

(6)洗脱缓冲液离子强度过低

增加洗脱缓冲液中的离子强度，在洗脱缓冲液中加入0.1~0.2M氯化钠也能提高洗脱效果。

答:1)蛋白质在宿主细菌中被降解

使用蛋白酶缺失菌株lon-或ompT，或ompT和lon的双缺失菌株。

2) GST融合蛋白被蛋白酶部分降解

加入蛋白酶抑制剂PMSF。

3)细胞破碎过程中超声过度

缩短裂解时间，在机械裂解前加入溶菌酶，可获得较好的裂解效果。避免起泡，因为这可能会使标记的蛋白质变性。过裂解也可导致宿主细胞蛋白和gst标记蛋白的共纯化。

4)分子伴侣可共纯化

多余的条带可能是由一些分子伴侣的共纯化引起的。这些分子伴侣参与了大肠杆菌中新生成蛋白质的正确折叠。例如:DnaK(分子量70 000)，DnaJ(分子量37 000)，GrpE(分子量40 000)GroEL(分子量57 000)，GroES(分子量10 000)。从这些共纯化蛋白中分离GST融合蛋白的几种方法已经发表。

答:蛋白质水解裂解发生在宿主细菌内。

探头，以检测何时出现的波段。如果确定在精确蛋白酶、凝血酶和凝血因子Xa裂解之前不存在多余的条带，这些条带可能是宿主细菌降解的结果。目标蛋白可能含有精密蛋白酶，凝血酶，凝血因子Xa的裂解位点，请检查顺序。

答:Co-IP利用抗原-抗体反应的特异性。GST pull down一般使用带有GST标签的重组蛋白，与目标蛋白孵育，最后与GST结合的珠粒进行相互作用复合物的下拉。