磷酸化位点鉴定
确定蛋白质的磷酸化位点有什么特别的注意事项?
有两个特别的考虑。
- 覆盖度:靶蛋白在质谱检测中的覆盖度越高，该蛋白被修饰基团修饰的概率越高，检测和位点定量的概率越高。
- 修饰位点比例:如果修饰位点比例低，检测到修饰肽的概率就低。一般情况下，如果比例大于30%，则该肽修饰位点极有可能被检测到。
磷酸化蛋白的Western Blot分析
如果目标蛋白是膜蛋白或细胞质蛋白，我需要注意什么?
答:如果目标蛋白是膜蛋白或细胞质蛋白，使用的洗涤剂要温和得多，最好加入NaF以抑制磷酸化酶活性。
Western Blot检测细胞信号转导和因子磷酸化的二抗要求是什么?
答:对二抗没有要求，这取决于你的实验条件，一般推荐使用酶标二抗。
我能在同一膜上检测到磷酸化的JNK和非磷酸化的JNK吗?
是的。
请问裂解细胞是使用三重去污裂解还是加载缓冲液?
答:使用顶部样品缓冲液，这有几个优点，它提取总蛋白，同时使磷酸化酶失活。
在制备蛋白质位于细胞核的大鼠脑Western Blot时，如何防止发生去磷酸化?
答:可以使用提取总蛋白的相同缓冲液来提取核蛋白，还可以添加NaF来防止去磷酸化。
我需要测量两个抗体，一个是磷酸化靶蛋白的抗体，一个是总靶蛋白的抗体，我想知道STRIP的最佳方法是什么?我使用甘氨酸(pH值2.9)15分钟，但它似乎没有工作?
答:可在56°C下加入巯基乙醇(与加载缓冲液浓度相同)30分钟。
是否有必要在磷酸化抗体测定的样品制备中加入NaF等?
答:不一定，NaF是一种广谱磷酸化酶抑制剂，通常最好添加它，但不添加它也可以。
我需要测量相同蛋白质的总量和磷酸化量，但是两者之间干扰太多，我该怎么办?
A:将膜置于溶出缓冲液(SDS 2%， Tris-Cl (pH=6.7) 62.5mM， β -巯基乙醇100mM)中，50°C孵育30分钟。用TTBS洗涤三次，重新加入其他抗原的一抗。
磷酸化修饰会使分子的分子量变大吗?如果我想从组织中检测蛋白质的磷酸盐呢?
A:每一种修饰，分子量增加80。通过SDS-PAGE直接测量磷酸化前后电泳迁移率的变化，磷酸化后蛋白质的电泳迁移率减慢。然而，这与蛋白质的性质、磷酸化位点的数量、前后分子量的变化等有关。
磷酸化西药和正常西药有什么区别?注意事项是什么?
答:蛋白质磷酸化是一个非常快速的反应，所以采集样品的过程应该是快速的，样品应该是新鲜的，最好有新鲜制备的裂解液。裂解物中必须含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。这也取决于被测蛋白质的磷酸化位点是什么氨基酸，如果是酪氨酸，也要加入1um的钒酸钠。
封闭式专业脱脂奶粉，经过特殊处理去脂，灭活蛋白激酶和蛋白磷酸酶活性。蛋白激酶的失活有助于保护野生型蛋白底物处于非磷酸化状态。蛋白质磷酸酶的失活可以保护磷酸化的蛋白质不被脱磷酸酶去磷酸化，从而保持蛋白质的磷酸化状态，并在不影响蛋白质底物性质的情况下提供最佳的western blotting，使其特别适合于蛋白质磷酸化和去磷酸化的研究。不含添加剂，室温下可在TBS或PBS缓冲液中迅速溶解。
我能用元钒酸钠代替原钒酸钠吗?
A:这两者不是一回事。原法尼酸钠，也称为正石榴酸钠，抑制磷酸酶。这保护了蛋白质的磷酸化位点。
我可以在剥离后重新检测磷酸化的蛋白质吗?
A:是的，但是要注意保持在低温下加工。除非特别需要，磷酸化作用最好第一次就搁置。
如果组织要检测磷酸化蛋白激酶水平，采集后必须立即储存在-80°C的干冰上吗?
A:尽可能多吃，但你不必那么严格，这取决于蛋白质的性质。
