在WB实验中应使用多少一抗和二抗?
答:根据不同抗体的效价、浓度和亲和力，大多数市售抗体的稀释比在1:20 -1:2000左右;二抗浓度一般在1:5000-1:0000左右。
建议先做预实验，可以先参考抗体说明书进行预实验，并根据预实验结果进行调整。
WB实验中的抗体是否可以推广到其他实验，如免疫组化?
答:在WB过程中，靶蛋白被SDS、巯基乙醇等变性剂变性，暴露蛋白内部的抗原表位，抗体识别靶蛋白的线性抗原表位。因此，大部分用于IHC、IP、FACS等实验的抗体都可以用于WB实验。
为什么目标带的大小有时会偏离理论预期的分子量?
答:当条带的实际大小与理论大小偏离时，可能是由多种原因造成的。
- 当蛋白质发生磷酸化、糖基化等翻译后修饰时，条带向上移动。
- 当蛋白质被剪切时，条带可能向下移动(例如前体)，或者可能有两个小的目标条带。
- 蛋白质有不同的可变剪切或异构体。
- 在强相互作用的大分子存在下，蛋白质变性是不完全的。
- 在WB实验中使用的预染色蛋白标记物也可能由于所携带染料的不稳定程度而偏离理论预期的表观分子量。
为什么有时会出现偏离的条带?
答:可能的原因包括抗体特异性不足、目标蛋白修饰状态不同或剪切降解、一抗或二抗使用过多、蛋白负荷过大、暴露时间长、膜冲洗不足等。通过优化条件可以使杂散带的出现最小化。然而，当由于抗体或样本特征而出现少量杂散条带时，只要不影响主要目标的条带识别，就不会影响数据图像的应用。
为什么这部电影的背景有时会明显变暗?
答:除了封闭度不够、样品中有杂质、抗体过多、漂洗不足等实验原因外，当目标波段信号太弱而无法具体识别时，必须延长曝光时间才能显示目标波段，从而使背景变脏。在这种情况下，整个反应的“性噪比”太低，最好使用特异性和亲和力更好的一抗。
为什么有时没有目标乐队?
A:可能的原因。
- 样品中所含目标蛋白表达过低或无表达，确认样品的可行性。
- 蛋白质在提取过程中被降解。低温提取蛋白，加入适当的蛋白酶抑制剂。
- 抗体孵育浓度过低或时间过短。优化抗体孵育量，一抗建议在4℃孵育过夜。
- 抗体是灭活的，应正确储存。
我的目标乐队很弱，我该如何加强它?
答:最重要的是要增加样本上的抗原量，而且一抗稀释倍数可以调高。
为什么目标波段是空白的并且被背景包围?
答:一抗浓度高，HRP对二抗的催化活性太强。显色底物处于临界点，反应时间不够长，无法完成对周围底物的催化，形成空白。
改进方法:降低一抗和二抗浓度，或更换新进口的显色底物。
如何对分子量很小的蛋白质(10KD左右)进行WB ?
答:尽量选用0.2 μm膜，以缩短转移时间。你也可以把两层膜叠在一起，然后电转移它们。
为什么这些条是笑脸形状的?
A:凝胶冷却不均匀，中间冷却不好;电泳系统温度过高，电场强度过大。
为什么这些条纹是皱眉头的形状?
A:可能是装置不当，也可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，也可能是两侧聚合不完全。
为什么条纹拖在后面?
A:样品溶性差或有一定程度的蛋白质降解。
为什么会有纹理(纵向条纹)?
A:样品中含有不溶性颗粒，可能是蛋白质提取有问题。
为什么条带是倾斜的?
A:电极不平衡或样品倾斜。
为什么条纹会在两边散开?
A:样品加入过多，扩散到井眼周围。减少样品体积或使用5X加载缓冲液。
要在细胞水平上进行WB，有多少细胞提取了足够的蛋白质来进行WB?
A:一般来说，5×106就足够了。特殊情况需要根据自己的研究来确定。
为什么我的胶卷是空白的?
答:排除以下问题后，再考虑一抗和抗原制备是否有问题
a)二抗HRP活性太强，底物被消耗
b) ECM底物中含有不稳定的过氧化氢。暴露在光照或高温下容易失活。
c) ECL衬底未覆盖到相应位置。
d)二抗过期，或一般因使用不当导致二抗失活。
是什么原因导致底片在显影剂中显影1分钟和5分钟后变暗?
A)可能是红光引起的，胶片本来是曝光的，可以在完全黑暗的情况下操作，看看是否有改善
b)显影时间过长，一般3-5分钟就够了，特殊情况需摸清显色时间。
同一蛋白质样品可以同时进行两种因素的WB测定吗?
A:当然，有些甚至可以同时测量几十个样品。如果抗体特异性高，效力高，同时使用2个一抗，可以在一个膜上检测到2个不同的蛋白质。
如果靶蛋白是膜蛋白或者细胞质蛋白，我应该注意什么?
答:如果是膜蛋白和细胞质蛋白，使用的洗涤剂要温和得多，最好加入NaF抑制磷酸化酶活性。一些膜蛋白不易提取，特别是亚细胞器膜蛋白。您可以考虑最新发明的柱式萃取法，萃取效率高，蛋白质损失少。
