高分子质量蛋白的二维PAGE协议在线调查

1.IEF用琼脂糖凝胶

1.1.凝胶制备

a)制备了3种琼脂糖IEF凝胶(长180 mm，直径3.4 mm)，分别含有1 M硫脲和6 M尿素。

b)琼脂糖IEF (0.10 g)和d -山梨醇(1.2 g)分别放入50ml烧杯中，在室温下溶解于5.8 mL蒸馏水(溶液a)中。

c)将A溶液在微波炉中煮沸10次，煮沸15 s，直至溶液变清，并在70°c水浴中保存5 min。

d)将尿素(3.6 g)和硫脲(0.76 g)粉末的混合物放入70℃的A溶液中，我们称之为B溶液。然后用蒸馏水将溶液B的体积调整到9.0 mL，室温保存。

e) B溶液分为三支试管:酸性1.0 mL，中性4.5 mL，碱性2.5 mL。

f) 4种Pharmalyte(酸性溶液pH 2.5-5.0，中性溶液pH 3.0-10.0，碱性溶液pH 4.0-6.5，碱性溶液pH 8.0-10.5)按表1所示方案分别加入管中。

g)事先准备好玻璃管(标准尺寸:260 mm × 3.4 mm内径)，管底覆盖透析膜，并用橡皮筋扎紧。

h)玻璃管连接AE-6300电泳装置(ATTO生产的琼脂糖IEF设备)。

i)将酸性、中性和碱性溶液分别通过30厘米长的聚乙烯细管，用一个注射器吸入。首先，将酸性溶液轻轻注射到玻璃管中，直到半月板达到距离管底20mm的高度。接下来，缓慢注入中性溶液，直到半月板达到距离底部135 mm的高度，然后小心地注入碱性溶液，直到半月板距离底部180 mm。在琼脂糖溶液上轻轻分层10 μL的覆盖液，使蛋白质更容易进入琼脂糖IEF凝胶。玻璃管中充满腔室并保持至少6小时，直到琼脂糖溶液凝胶化。

1.2.样品制备

将新鲜获得的哺乳动物组织切成小块，在液氮中快速冷冻，并在-80°C保存直至使用。每个冷冻组织片(约10mg)用聚四氟乙烯玻璃均质机在提取介质(组织片体积的20倍)(例如，脑、肌肉、肾脏和肝脏)中均质。将组织匀浆在112,000g下离心20 min，将清清上清用琼脂糖IEF凝胶处理。

1.3.样例应用程序

a)在凝胶的阴极端加入10-200 μL的蛋白质样品溶液，将样品溶液上方的覆盖溶液轻轻填充到玻璃管顶部。在下层储层中加入阳极缓冲液，在上层储层中加入阴极缓冲液。在600 V下，在4°C下进行了18 h的一维IEF。

b)然后将琼脂糖凝胶直接或固定凝胶中的蛋白质后转移到二维SDS凝胶的顶部。

2.Second-Dimensional sds - page

a)用于二次电泳的平板凝胶为12%聚丙烯酰胺凝胶(200 mm × 120 mm × 1.5 mm)。按照Laemmli的堆叠体系进行二次SDS- page，在堆叠和分离凝胶中分别添加1%的SDS。

b)将一维琼脂糖IEF凝胶不经SDS平衡加载在堆叠凝胶上，并用1%琼脂溶液覆盖以保持琼脂糖IEF凝胶的位置。在IEF凝胶上覆盖孵育培养基。

c)以40 Ma恒流开始二维凝胶电泳1 h，继续以70 Ma恒流进行电泳至电泳结束。

d)首先将板状凝胶在染色液中浸泡和摇匀过夜，去除凝胶中的pharmalyte(见注释6)。然后用含有PhastGel Blue R的染色液对板状凝胶进行染色，并用染色液进行染色。

3 IPG-Dalt与琼脂糖2-DE的比较

a)在本研究中，我们将琼脂糖2-DE体系与IPG-Dalt(固定化pH梯度用于IEF为第一维，SDS-PAGE为第二维)进行比较，以评估它们分析高分子质量蛋白的能力。

b)具有IPGs的第一维IEF基本上按照Gorg等人的描述进行。本研究使用IPG干条带(Immobiline drystrip pH 3.0-10.0 L)和Multiphor II (Amersham Biosciences)。

c)大鼠十二指肠的考马西染色2-DE图谱(图1)显示琼脂糖2-DE可以分析大于150 kDa的高分子量蛋白，而IPG-Dalt则不能。

参考

1. J. M.沃克(主编)。(2005)。蛋白质组学协议手册。胡玛纳出版社。