1.组织处理和蛋白质提取
1.1乙酸/巯基乙醇提取
已经开发了许多方法从组织中提取蛋白质进行蛋白质组学研究。AcOH/巯基乙醇方法非常适合于较大的组织标本，并且可以获得足够量的蛋白质进行多次实验。用这种方法生产的冻干材料可以保存很长一段时间，并可以在微天平上称出适当的量。所述冻干材料可在所选组合物的再水合缓冲液中再溶解，这提供了使用相同组织提取物进行不同类型实验的灵活性。使用这种方法，不需要将蛋白质与其他细胞成分分离。
1)快速称取冷冻组织标本(一般为0.4-0.5 g垂体组织)，切成几块;将组织片放入50毫升塑料管中。
2)用10ml冰冷的生理盐水冲洗纸巾三次(此时纸巾已经解冻)。
3)向组织中加入匀浆缓冲液10ml(使用前将缓冲液冷藏);将Polytron均质机的功率设置为6(均质过程中将混合物置于冰上，交替10 s均质，30 s静置;重复，直到组织完全破裂)。
4)均质后，将均质液超声10 s(超声时将均质液置于冰上);重复这个步骤。
5)将匀浆分成1ml的馏分;将这些馏分冻干。
6)测定冻干物中的蛋白质浓度。
7)将冻干品保存在-80°C，以待下次使用。
1.2 TRIZOL试剂萃取
基于trizol的方法非常适合于大型组织标本。用这种方法，细胞蛋白从RNA和DNA中分离出来。蛋白质提取物的长期储存可能会导致随后的溶解问题。
1)迅速称好冷冻组织标本的重量，切成几块;将这些碎片放入14ml的塑料管中。
2)用5毫升冰冷的生理盐水冲洗三次。
3)每克组织加入4ml TRIZOL试剂。
4)将混合液均质，均质机功率设置为6;(均质过程中，将混合物置于冰上，交替10 s均质，30 s静置;重复这一步骤，直到组织被完全破坏)。
5)均质后;对样品进行超声处理(将悬浮液放在冰上，交替进行10秒超声处理和30秒静置;重复这个步骤三次)。
6)在4°C下将样品涡旋4小时。
7)每使用1 mL TRIZOL试剂加入0.2 mL氯仿。
8)在12,000g下离心10分钟。混合物将分离成三个相:上相(水相)、间相和下相(有机相)。
9)除去上层(水)相。
10)下相(间相和有机相)，每使用1 mL TRIZOL试剂，加入0.3 mL乙醇;颠倒混合。
11) 2500g离心5分钟。
12)抽出上清液，在上清液中加入体积为上清液体积5倍的丙酮;颠倒混合。
13)在12,000g下离心10分钟，离心后取下并丢弃上清。
14)用含有0.3 M胍- hcl的95%乙醇(每1 mL TRIZOL试剂使用2 mL)洗涤蛋白颗粒;重复三次。
15)将蛋白颗粒在2ml乙醇中涡流，将蛋白颗粒在乙醇中储存20分钟，7500g离心5分钟。
16)去除乙醇，将颗粒溶解于2-3 mL不含染料的IEF补液缓冲液中。
17)测定蛋白质浓度。
18)将样品分馏，保存在-80°C，待进一步使用。
2凝胶IEF
2.1 IEF样品制备
1.称出所需的垂体冻干液的分量;或量出TRIZOL提取物。
2.加入360 μL的IEF复水缓冲液。
3.将样品混合物涡旋1h;在20、40和60分钟，用探头声呐器对样品进行20秒的声呐处理。
4.将样品在21,000g下离心30分钟。
5.取出IPG条带;用一个永久性的记号笔，在塑料背面勾勒出稍后要切割的部分。
6.将350 μL的样品溶液加入到DryStrip膨胀盘的插槽中。
7.从IPG试纸上取下保护罩，将IPG试纸凝胶面朝下置于样品溶液的顶部。
8.用3毫升油覆盖试纸条以防止蒸发。
9.给IPG条补水过夜。
2.2.等电点聚焦
1)将MultiTemp循环器设置为20°C。
2)在Multiphor II装置的冷却板上倒入4ml油(盖液);将DryStrip运行托盘放置在冷却板上;将电极线连接到适当的位置。
3)向DryStrip托盘中倒入10 mL油;将IPG条带对准器放在油的顶部。
4)将两条电极纸剪成110毫米长，用0.5毫升水湿润(应刚受潮)。
5)将再水化的IPG条从溶胀盘中提起;用水冲洗凝胶表面;在一张纸上轻轻扫去胶带背面多余的油。
6)将IPG条带放入条带对准器的凹槽中，凝胶面朝上，方向正确。
7)将湿电极纸条置于IPG条的阴极和阳极两端;电极纸条必须与IPG条的凝胶端接触。将电极放置在电极纸条上并向下按压，使其与电极纸条接触。
8)向托盘中倒入70-80 mL油，使其完全覆盖IPG条。
9)按照以下方案进行IEF: 0-100 V(梯度大于1分钟);100v(固定120分钟);100 - 500v(梯度大于1min);500 - 3500v(梯度超过90分钟);3500v(固定8小时)。
10) IEF完成后，取下IPG条，擦去多余的油，用保鲜膜松散地覆盖IPG条;将包装好的IPG条保存在-80°C，直到进一步处理。
3 IPG条带的处理和蛋白质消化
1.用200mm碳酸氢铵冲洗IPG条10 s。
2.将试纸条在10ml 200mm碳酸氢铵中孵育10min。
3.用干净的手术刀将其分成凝胶部分;将每个凝胶切片放入0.5 ml硅化埃彭多夫管中。
4.各切片用50 μL乙腈脱水;重复两次(见注24)。
5.凝胶切片在真空离心机中干燥30分钟。
6.每个凝胶切片用含有胰蛋白酶(20 μg/mL)的碳酸氢铵(50 mM) 100 μL复水。
7.将样品在37°C的水浴中孵育过夜。
8.消化后，样品在10,000g下离心1分钟，将每个上清转移到干净的0.5 ml管中。
9.在每个凝胶切片中加入70 μL乙腈/水/三氟乙酸(50:45:5;V: V: V)，在声纳浴中对样品进行20分钟的超声处理;收集上清液，再次重复提取;混合每个凝胶部分的所有提取物。
10.在真空离心机中干燥样品。
11.样品用15 μL水/0.1%三氟乙酸复溶。
12.将样品在10,000g下离心1分钟。
13.按照制造商的说明，用ZipTip小贴士净化消化液;用3 μL乙腈/水(50:50)洗脱ZipTip上的多肽;v: v)。
14.洗脱液中加入3 μL水/1%乙酸/ 0.02%七氟丁酸。
15.将肽样品保存在-20°C直到分析。
4质/女士
为获得肽序列数据，利用LC-MS/MS对IPG条带各部分的消化酶进行分析。本实验采用水/乙腈梯度反相高效液相色谱法对多肽混合物进行分离。液相色谱柱洗脱的多肽在线导入质谱仪进行分析。质谱分析在数据依赖模式下进行，仪器在MS和MS/MS之间切换。通常，获得全扫描质谱来确定肽的分子质量，然后获得MS/MS(产物-离子)光谱用于几个肽序列诊断。在整个运行过程中重复此循环，从而产生给定消化肽的大量MS/MS数据。在本实验中，质谱仪在获得全质谱扫描和对质谱扫描中最丰富的离子进行5次MS/MS扫描之间循环。
5数据库搜索
MS/MS数据用于检索蛋白质序列数据库(Swiss-Prot或NCBInr)，以鉴定IPG条带各部分的蛋白质。数据库搜索结果是手动检查，以确定检索到的蛋白质显著得分，并消除假阳性命中。
参考
- J. M.沃克(主编)。(2005)。蛋白质组学协议手册。胡玛纳出版社。