凝胶内消化和质谱分析蛋白质鉴定方法在线调查

1.SDS丙烯酰胺凝胶

使用震动平台可以更有效地清洗这些步骤的凝胶。

a)在合适的条件下运行一维或二维SDS丙烯酰胺凝胶。
b)在200毫升水中洗涤5分钟，重复三次。
c)用SYPRO荧光染料或0.1%考马斯蓝胶体染色凝胶观察蛋白约1小时。
d)水中去污1-2小时。

2.为胶液消化

更有效地去除缓冲液和溶剂从凝胶片可以实现P1000移液管尖端与P10尖端粘在末端。

a)切除染色的凝胶带(用SYPRO或胶体考马斯蓝鉴定)，切去中心(凝胶带最集中的部分)，以尽量减少丙烯酰胺的含量。
b)在约200 μL 0.2M NH中孵育3次₄HCO_3./50%乙腈)，每次30分钟，在30°C下去除SDS。
c)凝胶带在DTT (20 mM)中，于200-300 μL 0.2 M NH4HCO3/50%的乙腈水溶液中，30℃下孵育1 h，使蛋白质还原。
d)用约200 μL 0.2 M NH洗涤三次₄HCO_3.乙腈/ 50%。
e)新鲜碘乙酰胺(50 mM)中烷基化半胱氨酸残基，浓度为100 μL, 0.2 M nhh₄HCO_3./50%乙腈，室温下避光20分钟。
f)用500 μL 20 mM NH洗涤3次₄HCO_3.乙腈/ 50%。
g)将带子切成1 × 2毫米的小片。
h)在10000g(或最高转速)微离心机中离心2分钟。
i)用乙腈覆盖(必须变成不透明的白色)。
j)在离心式蒸发器中进行离心冻干，使凝胶带完全干燥。30分钟)。
k)用胰蛋白酶溶液将凝胶带补水。使用60 μL 50 mM NH新鲜配制的约0.5-1.0 μg胰蛋白酶₄HCO_3.，在4°C下放置15-30分钟。
l)加入足够的消化缓冲液，最多可达100 μL左右，即足以覆盖凝胶片。
m)在32°C孵育过夜，即:，约16小时。

3.肽提取

a)第二天，在10000g(或最高转速)微离心机中离心2分钟。
b)收集凝胶片上方的消化缓冲液。
c)在凝胶片中加入100-200 μL的50%乙腈，在声波浴中进行大约声波处理。30 min(35-40℃)，静置1 h，照常离心，收集上清。
d)将乙腈萃取液在离心蒸发器中干燥至约20-50 μL，然后与水萃取液混合。
e)总体积约为100-150 μL。如果不立即用质谱分析，请保存在-20°C。
f)通过串联ESMS或MALDITOF ms进行质量指纹和/或测序的脱盐肽。对于离子阱质谱仪上的纳米喷雾，使用4中描述的方案。

4.小蛋白(<60 kDa)的纳米喷雾质谱鉴定

a)对于nanospray MS，将C8反相柱(0.8 mm × 2mm)与PTFE管(3.5 cm)配合在进口端，使注射器针头贴合。用5.5厘米的50 μ熔融石英管(见注6)安装出口端，使其插入纳米喷射针。
b)用200 μL甲酸(0.01% 95%乙腈)清洗C8反相柱(0.8 mm × 2mm)。
c)用约200 μL甲酸水溶液(0.01%)平衡色谱柱。
d)用25 μL Hamilton注射器将样品(溶解在约20 μL 0.01%的甲酸水溶液中)缓慢上样。如果溶液更稀(即，如果需要更多的样品以获得良好的光谱)，则加载至3 × 25 μL。
e)用15 μL甲酸水溶液(0.01%)洗涤柱。
f)用含60%甲醇的甲酸水溶液(0.01%)直接洗脱到纳米喷雾针中，允许2 μL进入针内。
g)使用后，将色谱柱保存在95%的乙腈水溶液中。