1.用ICAT试剂标记蛋白质
通常，蛋白质溶液需要通过三氯乙酸(TCA)沉淀或其他相容的清洁方法来清洁(去除盐和洗涤剂)。除去盐和洗涤剂后，将样品溶解在最小体积的标记缓冲液中。标记缓冲液的体积和ICAT试剂的化学比例可以根据样品的数量进行缩放，以达到约3mm的ICAT浓度。
以下方案是基于用两种ICAT试剂中的每一种标记500 μg蛋白质。如果使用的量不是500 μg，那么标记缓冲液的体积和ICAT试剂的化学比例可以根据这里使用的量按比例调整。
1)将对照和测试样品中干燥或沉淀的蛋白质溶解在最小体积的新鲜制备的标记缓冲液中。
2)分别测定对照和测试样品中的蛋白质含量。每个样品保存1份等分液(约1 μg)，以在标记结束时通过SDS-PAGE监测标记效率。
3)将Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP)加入蛋白质样品溶液中至终浓度5mm。
4)加入5倍摩尔过量的ICAT试剂(见注3)，使蛋白质样品溶液的终浓度达到2.5-3.0 mM。混合均匀，在黑暗中37°C下用管摇杆轻轻摇晃悬液2小时。
5)加入5倍摩尔量的二硫苏糖醇(DTT)，使反应淬灭，室温孵育5min。从每个样品中保存一等分(约1 μg)的蛋白质以监测标记效率。
6)将对照和试验标记的样品混合，用50 mM Tris-HCl (pH 8.3)缓冲液稀释混合后的样品，直至尿素终浓度为1m。
7)加入胰蛋白酶1:100 w/w(胰蛋白酶/蛋白)，37℃孵育过夜。
8)用SDS-PAGE分析ICAT标记效率和胰蛋白酶消化，然后用步骤2和5中保存的等分进行银染色。
用强阳离子交换色谱法对样品进行清理和分离
使用强阳离子交换色谱法纯化组合样品取决于样品体积和复杂程度。对于不太复杂的样品或可用蛋白有限的样品(例如，总蛋白约100 μg)，应考虑使用ICAT试剂盒(Applied Biosystems)中的阳离子交换盒制备单个组分进行阿维菌素亲和纯化。然而，对于高度复杂的样品(即总蛋白的0.5-1 mg)，建议通过强阳离子交换(SCX)将样品分成25-50份。
本节介绍SCX色谱系统对样品的分离。
1)用稀释的磷酸将样品酸化至pH 3.0，上至SCX柱。
2)在60分钟内，使用KCl从0到100% B的线性梯度从SCX柱上洗脱icat标记的肽，并以适当的间隔将部分收集到玻璃小瓶中(放置在2ml微管中)。
Avidin亲和试剂盒纯化多肽
1)用500 μL负载缓冲液将收集到的每个阳离子交换分数中和至pH 7.2。
2)缓慢加载(约1滴/秒)中和的部分到亲和素筒，收集并保存流动到一个玻璃小瓶。
3)再加500 μL上样缓冲液，将流量收集到同一管中。
4)注入1ml洗涤缓冲液。丢弃输出。
5)注入1ml洗涤缓冲液。丢弃输出。
6)用800 μL的洗脱缓冲液(约1滴/秒)洗脱标记的肽，收集到玻璃小瓶中。
7)对剩余的阳离子交换分数重复步骤1-6。
icat标记多肽中生物素亲和标签的切割
1)用SpeedVac完全干燥每个馏分。
2)将95 μL的切割试剂a和5 μL的切割试剂B混合在玻璃小瓶中制备切割试剂。
3)旋涡混合，并将裂解试剂转移到玻璃瓶中的干燥部分。
4)盖上每个玻璃瓶，在37℃下孵育2小时。
5)用SpeedVac将样品完全干燥。
6)在干燥的颗粒中加入合适的溶剂进行质谱分析。
7)涡旋，离心，小心转移到合适的试管中，保存在-80°C，以待microLC-MS/MS。
5糖肽的分离与分析
糖蛋白氧化:用高碘酸钠氧化将碳水化合物的顺式二醇基转化为醛类。
2)偶联:醛类与固定在固体载体上的肼基反应形成共价腙键。非糖基化蛋白被去除。
3)蛋白水解:将固定的糖蛋白在固体载体上用胰蛋白酶进行蛋白水解。非糖基化的肽通过洗涤去除，而糖基化的肽仍然与固体载体共价结合。
4)同位素标记:赖氨酸的ε-氨基转化为精氨酸后，固定化糖肽的α-氨基被同位素轻(d0)或重(d4)形式的琥珀酸酐标记。
5)释放:原n链糖肽经PNGase F处理从固相中释放。
6)分析:采用微毛细管高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱(microLC- esi -MS/MS)或微lc分离-基质辅助激光解吸/电离(MALDI) MS/MS对分离肽进行鉴定和定量。
5.1糖肽的分离
1)将1 mg蛋白悬浮于100 μL含有100 mM NaOAc, 150 mM NaCl (pH 5.5)的偶联缓冲液中。
2)在样品溶液中加入高碘酸钠溶液至终浓度15mm。混合均匀，在室温下，在黑暗中用摇杆轻轻摇动悬浮液60分钟。
3)用脱盐柱除去样品中过量的高碘酸钠。
4)将偶联缓冲液中平衡的肼树脂加入样品中(1 mL凝胶/5 mg蛋白质)。混合均匀，在室温下用摇杆轻轻摇晃10-24小时。
5) 1000g下旋10分钟，用1ml 8 M尿素/0.4 M NH洗涤树脂三次去除非糖蛋白4HCO3.．
6)用2 M尿素/0.1 M nhh将蛋白质悬浮在树脂上4HCO3.，加入胰蛋白酶1:100 w/w(胰蛋白酶/蛋白)，37℃孵育过夜。
7)加入8 mM TCEP (Pierce, Rockford IL)室温还原30 min，还原后加入10 mM碘乙酰胺室温烷基化30 min。
8)去除未结合的胰蛋白酶化肽。
9)用1 mL 1.5 M NaCl, 80%乙腈，100%甲醇，0.1 M nh3次清洗树脂上的肽段4HCO3.六次。
10)用0.5 mL的0.1 M NH悬浮树脂4HCO3.用0.5 μL的肽- n -糖苷酶F在37℃下孵育过夜，从树脂中释放n -连接的糖肽。
11)将珠子上的溶液收集到干净的玻璃管中，用200 μL 80% CH3CN/0.1% TFA洗涤树脂2次，将上清液混合在玻璃管中。
12)用SpeedVac将混合的上清完全干燥，悬浮在0.4%醋酸中进行LC-MS/MS分析。
5.2同位素标记糖肽类
1)用丁二酸酐对糖肽进行同位素标记时，将附着在树脂上的糖肽用15%的NH洗涤2次4水中OH (pH > 11.0)。
2)在15% NH4OH (nhh)中加入1 M的甲基异脲4哦/小时2O = 15/85 v/v)，超过胺基100倍摩尔过量，在55°C下孵育10分钟。
3)用水洗涤两次，二甲基甲酰胺(DMF)/吡啶/H2O = 50/10/40 (v/v/v)洗涤两次，在DMF/吡啶/H中重悬2O = 50/10/40 (v/v/v)。
4)加入丁二酸酐溶液至终浓度为2mg /mL。将混合物在室温下孵育1小时。
5)用DMF洗涤三次，用水洗涤三次，0.1 M nh6次4HCO3.．
6)按照描述使用肽- n -糖苷酶F从微球中释放肽。
参考
- J. M.沃克(主编)。(2005)。蛋白质组学协议手册。胡玛纳出版社。