SILAC全球磷蛋白质组学分析协议在线调查

1 SILAC标签

a)将对照细胞系和受激细胞系在特定培养基(如DMEM)中繁殖进行比较。一个细胞系应该在含有轻氨基酸的培养基中生长，而其他细胞系应该在含有表1中列出的重氨基酸组合之一的培养基中生长。

表1推荐用于多路SILAC实验的重氨基酸

b)在开始实验之前，每个细胞系必须首先适应以确保完全融合。一般来说，五个段落就足够了。

2细胞裂解

a)将培养基替换为无血清培养基，再培养12 - 18h。

b)用PBS洗涤细胞两次，并用所需量的配体(如EGF)刺激其中一个细胞群。

c)用冷PBS洗涤细胞三次。

d)对于150mm的细胞培养板，将其放在冰上，用15ml预冷裂解缓冲液冲洗，缓冲液应该是新鲜制备的，并加入磷酸酶抑制剂。

e)用一次性细胞刮板轻轻将细胞从培养板中取出，将培养液置于50ml离心管中。让试管在4°C下缓慢摇晃一个小时。

f)将细胞裂解液在4℃下12,000 × g离心，去除不溶性碎片。

3丙酮沉淀

a)用5倍体积的冷丙酮在- 20°C下沉淀裂解物中的蛋白质，过夜。

b)将丙酮/裂解液混合物(12,000-15,000 × g)在4°C下旋转15分钟，回收沉淀。

c)小心地除去上清，并将颗粒放在干净的罩中干燥。

d)用200 μL溶出缓冲液回收蛋白颗粒，30℃恒温孵育，不定期搅拌。

e)按照制造商的说明，用Bio-Rad蛋白测定法测量每个样品的总蛋白浓度。

f)在1.5 ml微离心管中配制100-200 μg总蛋白等分液。

g)将样品在液氮中快速冷冻，如果不立即使用，则保存在- 80°C。

h)还原，烷基化并用于溶液中胰蛋白酶消化(5)。

4 sds -聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

a)每个样品，以10-15的体积将总蛋白100-200 μg与SDS-PAGE上样缓冲液5 μL混合。

b)在95℃下加热样品5分钟。

c)让样品在室温下冷却5分钟。

d)将样品装入预制的微型凝胶中，组装在带有SDS-PAGE运行缓冲液的Novex微型细胞上。

e)在200 V下进行电泳，直到上样缓冲液到达凝胶底部。

f)将凝胶转移到干净且有盖的容器中。

g)用H清洗凝胶₂两次简短的回答。

h)用胶体考马斯蓝染色。

还原和烷基化

a)将每个凝胶道切成约1mm的小块。

b)将凝胶块转移到干净的1.5 ml微离心管中。

c)用1:1的50mm NH染色凝胶片₄有限公司_3./乙腈混合物至少2小时。

d)用H逐步清洗样品₂O和H₂O/乙腈每次15min。重复这个步骤一次。

e)用乙腈100%脱水15分钟。

f)将脱水的凝胶片用1ml还原液膨胀，60℃孵育60分钟。

g)将反应置于室温下冷却。

h)丢弃还原溶液。

i)每管加入1ml烷基化溶液，室温避光孵育30分钟。

凝胶蛋白消化

a)用H逐步清洗样品₂O和H₂O /乙腈。

b)用乙腈100%脱水凝胶片。

c)用预冷的50 Mm氮气溶解冻干的胰蛋白酶₄有限公司_3.浓度为10 ~ 15 ng/μL。

d)用新鲜溶解的胰蛋白酶在冰上膨胀脱水凝胶片，使用的体积略大于每管中干燥凝胶片所需的体积。

e)将样品在冰上孵育45分钟。

f)除去多余的液体，用大约相同体积的50mm NH替换₄有限公司_3.，但不含胰蛋白酶。

g)在37℃下反应12-14小时。

h)用1:5 v/v的10%醋酸溶液停止胰酶消化管。

i)将上清转移到干净的1.5 ml微离心管中。

j)分别用0.1%醋酸、0.1%醋酸与50%乙腈和100%乙腈孵育三次，提取凝胶基质中剩余的肽段。

k)对于每个样品，将上述洗涤和脱水步骤中的肽转移到收集上清液的管中，副标题6，步骤h。

l)真空离心干燥每个样品。

7利用TiO进行亲和富集₂

a)将干燥后的样品重新溶解在1ml的TiO中₂加载解决方案。

b)施加强力涡流以确保样品的回收，并短暂旋转以去除不溶性颗粒。

c)转移10 μL的a /1 H₂O / TiO₂将每个样品的浆液倒入1.5 ml干净的微型离心管中。

d)用TiO进行悬挂₂在每根管中加入1ml的TiO₂加载解决方案。

e)平衡TiO₂搅拌15分钟，缓慢摇晃。

f)旋转TiO₂低速下短暂浆化。

g)丢弃TiO₂用于平衡的加载溶液。

h)子标题7步骤a中每个再溶解样品，加入10 μL平衡的TiO₂泥浆。

i)允许磷酸肽与TiO结合₂物料缓慢摇摆30分钟。

j)简单旋转样品。

k)将上清(非结合肽溶液)转移到1.5 ml干净的微型离心管中。

l)小心地将TiO重新溶解₂在100 μL的TiO中加入微球₂清洗解决方案。

m)将上述浆料缓慢摇晃15分钟。

n)重复上述步骤三次。

o)小心地溶解TiO₂添加100 μL 25% NH的颗粒₄pH值10.5下的OH。

p)将浆液缓慢摇晃15分钟。

q)再次重复上述步骤，以确保完全洗脱结合的肽。

r)加入适量的10%乙酸，将200 μL磷酸肽洗脱液的pH调至pH 7.5。

s)在真空离心机中干燥子标题7步骤k(非结合肽溶液)和子标题3.7步骤r(磷酸肽洗脱)中获得的样品。

t)将肽溶解在LC-MS溶剂中，用于磷酸肽分析。

8强阳离子交换(SCX)色谱

a)富含TiO的溶解样品₂再溶于1ml scx上样液中。

b)将样品注入SCX柱，开始色谱实验。

c)对于与自动进样器耦合的离线lc系统，SCX梯度如下:

-从0%溶液B开始运行70分钟

- 0-20分钟，等压0%溶液B

- 20-22分钟，0-8%溶液B

- 22-48分钟，8-35%溶液B

- 48-58分钟，35-100%溶液B

- 58-68分钟，100%溶液B

- 68-69.5 min, 100-0%溶液B

- 69.5-70 min, 0%溶液B结束

多肽可以在PolySULFOETHYL A (PolyLC, Columbia, MD)柱(100 × 2.1 mm, 5-μm颗粒，300个Å孔)上使用强阳离子交换色谱进行分离。SCX色谱可以使用连接到Probot馏分收集器的终极高效液相色谱系统(LC填料)进行。SCX组分(0.5 mL)可以使用0-350的SCX溶液B的非线性梯度收集。首先20分钟，注入SCX溶液a以清洁SCX结合的肽，随后使用0-35%的SCX溶液B分离30分钟，将溶液B增加到100%，持续15分钟。

d)根据色谱剖面，将洗脱等分数收集。

e)真空离心干燥每个SCX馏分。

9肽脱盐

LC-MS/MS前的最后一步是用Poros 20 R2材料分批反相色谱法对SCX馏分进行脱盐。

a)用1ml上样RP-C溶液重新溶解上述子标题8步骤e中获得的干燥样品。

b)施加强力涡流，保证样品的回收。

c)将每个样品少量的Poros 20 R2转移到1.5 mL清洁的微型离心管中。

d)每管加入1 mL RP-C上样液，用Poros 20 R2制作混悬液。

e)缓慢摇动，使Poros 20 R2材料平衡15分钟。

f)低速旋转Poros 20 R2浆料。

g)丢弃用于平衡的加载液。

h)将每个再溶解样品加入平衡的Poros 20r2等分液中。

i)孵育1小时，慢摇。

j)简单旋转样品。

k)丢弃上清。

l)在100 μL RP-C洗涤液中仔细重溶Poros 20r2微球。

m)慢摇15分钟。

n)重复上述步骤三次。

o)用100 μL RP-C洗脱液仔细溶解Poros 20 R2微球。

p)将浆液缓慢摇晃15分钟。

q)再次重复上述步骤，以确保完全洗脱结合的肽。

r)用真空离心机干燥每个脱盐样品。

s)需要时，将样品重新溶解在合适的LC-MS/MS上样液中。

使用TiO2进行具有代表性的silac磷酸化蛋白质组学分析的步骤示意图。

参考

1. de Graauw, M.(2009)。Phospho-Proteomics。胡玛纳出版社。